本發(fā)明屬生物，涉及一種油菜類受體基因bnrlp41在菌核病防控中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、1、植物基因功能分析技術(shù)

2、植物基因功能通常通過比較分析基因的超常規(guī)表達(dá)與正常表達(dá)情況下的表型(phenotype)或功能發(fā)揮情況來判斷和明確。基因的超常規(guī)表達(dá)包括高于正常水平的表達(dá)和低于正常水平的表達(dá)兩大類。高于正常水平的表達(dá)主要為超表達(dá)/過表達(dá)(over-expression)，主要通過連接一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)的方式來達(dá)到。低于正常水平的表達(dá)主要通過rna干擾(rna?interfering,rnai)、基因敲除(knock-out)等方式來達(dá)到。rnai通過構(gòu)建和轉(zhuǎn)化一個(gè)含有同一序列片段相反方向插入一個(gè)內(nèi)含子或其它不表達(dá)的序列形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)，結(jié)果是目的基因表達(dá)的降低?；蚯贸齽t通過在植物基因組中的目的基因中插入一個(gè)長(zhǎng)的非植物序列或切除目的基因等方式來達(dá)到，結(jié)果是目的基因表達(dá)的完全或近乎完全的抑制。通過構(gòu)建基因超表達(dá)植株和/或rnai植株、基因敲除突變體，比較分析其表型和性狀與野生型/正常植株的差異，可明確目的基因?qū)υ撔誀畹恼{(diào)節(jié)功能。

3、2、植物抗病遺傳學(xué)調(diào)控技術(shù)

4、植物抗病性是由植物受體識(shí)別病原物配體激活抗病信號(hào)傳導(dǎo)、活化系列防衛(wèi)反應(yīng)而產(chǎn)生的結(jié)果。從遺傳學(xué)上看，受體-配體識(shí)別后，激活抗病信號(hào)傳導(dǎo)，活化免疫抗病反應(yīng)。植物面對(duì)病原菌入侵時(shí)，由植物細(xì)胞膜表面的模式識(shí)別受體特異性地識(shí)別病原菌保守的分子模式來啟動(dòng)第一層先天免疫系統(tǒng)。對(duì)病原的識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并激活胞內(nèi)抗病途徑對(duì)于抗病反應(yīng)產(chǎn)生至關(guān)重要。類受體蛋白(receptor-like?protein,rlp)是目前已知的植物識(shí)別病原分子模式的兩大類受體之一。利用rlp基因創(chuàng)制抗病性增強(qiáng)的作物種質(zhì)預(yù)計(jì)效果好，但目前這方面的公開報(bào)告極少。

5、3、植物菌核病防控技術(shù)

6、植物菌核病由核盤菌(sclerotinia?sclerotiorum)侵染所致。核盤菌是壞死營養(yǎng)型(necrotroph)病原真菌，寄主范圍極廣，是油料作物以及蔬菜作物等的主要病害。每年造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。由于缺乏高抗品種，化學(xué)防治仍然是重要手段。由于一些農(nóng)藥存在生態(tài)污染、人畜毒害、易使病原物產(chǎn)生抗藥性等問題，鑒定重要抗菌核病調(diào)控基因，創(chuàng)制和利用抗病品種，對(duì)于菌核病的綠色防控至關(guān)重要。

7、4、植物抗病育種技術(shù)

8、植物抗病育種技術(shù)主要分為傳統(tǒng)抗病育種和通過基因工程抗病育種兩大類。傳統(tǒng)抗病育種因?yàn)橛刑烊贿z傳隔離現(xiàn)象使抗病資源可用范圍受到顯著限制，只能應(yīng)用遺傳關(guān)系較近的抗病資源，而且需要多次雜交和回交等，因此選育周期長(zhǎng)，且需要大量人力物力。而基因工程育種方法是通過將外源的抗病調(diào)控基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法等技術(shù)導(dǎo)入植物，使其獲得原來不具有的抗病性。因此，基因工程育種方法打破了天然遺傳隔離現(xiàn)象的限制，拓寬了抗病資源可用范圍，而且具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單方便、培育周期短、無需大量人工物力的特點(diǎn)。另外，可通過導(dǎo)入一個(gè)廣譜抗病調(diào)控基因，或者多個(gè)不同抗病譜的基因，創(chuàng)制具有廣譜抗病的品種。因此具有特別適宜培育廣譜、持久抗病品種等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種油菜(brassica?napus)類受體基因bnrlp41在菌核病防控中的應(yīng)用，所述油菜類受體基因bnrlp41對(duì)抗病性有調(diào)控功能，可應(yīng)用于抗核盤菌(sclerotinia?sclerotiorum)作物種質(zhì)的創(chuàng)制。

2、所述應(yīng)用是通過創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因油菜來獲取抗病性得到改變的油菜材料中的應(yīng)用。是通過創(chuàng)制超表達(dá)bnrlp41的轉(zhuǎn)基因油菜來獲得增高菌核病抗性的油菜材料中的應(yīng)用，或通過創(chuàng)制bnrlp41-crispr基因敲除轉(zhuǎn)基因油菜來獲得減弱菌核病抗性的油菜材料中的應(yīng)用。

3、本發(fā)明以油菜(brassica?napus)中雙11品種cdna為模板，通過pcr克隆獲得油菜基因bnrlp41，其核苷酸序列如seq?id：1所示，該基因的開放閱讀框(orf)長(zhǎng)2655bp，編碼的蛋白由884個(gè)氨基酸組成，其序列如seq?id：2所示。bnrlp41蛋白包含lrr結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明克隆的核苷酸序列與ncbi數(shù)據(jù)庫中油菜品種zs11的loc106447094核苷酸序列一致、蛋白序列與xp_013744403.2相同。

4、在本發(fā)明之前，該基因的功能沒有任何公開報(bào)告。本發(fā)明首次通過構(gòu)建該基因的超表達(dá)和crispr敲除轉(zhuǎn)基因油菜及其抗病分析，闡明了該基因?qū)τ筒司瞬】剐缘恼{(diào)控作用。結(jié)果顯示，與野生型油菜植株相比，超表達(dá)轉(zhuǎn)基因油菜植株顯著更抗核盤菌，而敲除轉(zhuǎn)基因植株顯著更感核盤菌，說明bnrlp41正調(diào)控油菜對(duì)核盤菌的抗性。

5、基于以上本發(fā)明闡明的bnrlp41基因功能，本發(fā)明的應(yīng)用目的是提供所述的油菜bnrlp41基因通過創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因油菜來獲取抗病性得到改變的油菜材料中的應(yīng)用，包括(1)在通過創(chuàng)制超表達(dá)bnrlp41的轉(zhuǎn)基因油菜來獲得增高對(duì)菌核病抗性的油菜材料中的應(yīng)用(實(shí)施例1)；以及(2)在通過創(chuàng)制bnrlp41-crispr基因敲除的轉(zhuǎn)基因油菜來獲得減弱對(duì)菌核病抗性的油菜材料中的應(yīng)用(實(shí)施例2)。

6、油菜bnrlp41基因在通過創(chuàng)制超表達(dá)bnrlp41的轉(zhuǎn)基因油菜來獲得增高對(duì)菌核病抗性的油菜材料中的應(yīng)用，具體通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：

7、(1)bnrlp41基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和獲?。簩nrlp41基因開放閱讀框(orf)克隆入一個(gè)植物表達(dá)載體，使其受強(qiáng)啟動(dòng)子的驅(qū)使表達(dá)；

8、(2)轉(zhuǎn)化bnrlp41基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌的獲?。簩?gòu)建好的bnrlp41基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)通過電擊等方法轉(zhuǎn)化對(duì)油菜具有強(qiáng)侵染能力的農(nóng)桿菌菌株；

9、(3)超表達(dá)bnrlp41的轉(zhuǎn)基因油菜創(chuàng)制和獲取：通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將bnrlp41基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)導(dǎo)入油菜，獲取轉(zhuǎn)bnrlp41基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)的油菜；

10、(4)超表達(dá)bnrlp41的轉(zhuǎn)基因油菜純合系的獲?。悍謩e以抗生素抗性和bnrlp41基因表達(dá)為檢測(cè)指標(biāo)，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株后代的性狀分離情況，獲取后代性狀不再分離的、并能穩(wěn)定遺傳的超表達(dá)bnrlp41的轉(zhuǎn)基因油菜純合系；

11、(5)菌核病抗性增高的超表達(dá)bnrlp41的轉(zhuǎn)基因油菜純合系篩選鑒定和獲?。阂猿磉_(dá)bnrlp41的轉(zhuǎn)基因油菜純合系為材料，檢測(cè)分析對(duì)菌核病的抗性，獲取抗病性增高的轉(zhuǎn)bnrlp41基因油菜。

12、油菜bnrlp41基因在通過創(chuàng)制bnrlp41-crispr基因敲除的轉(zhuǎn)基因油菜來獲得減弱菌核病抗性的油菜材料中的應(yīng)用。通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：

13、(1)bnrlp41基因crispr敲除結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和獲取：根據(jù)bnrlp41基因組序列預(yù)設(shè)3個(gè)20bp的敲除靶標(biāo)，將靶點(diǎn)序列克隆入植物表達(dá)載體pbsbdcas9i，經(jīng)過菌落pcr鑒定和測(cè)序獲得重組結(jié)構(gòu)pbsbdcas9i-bnrlp41；

14、(2)轉(zhuǎn)化bnrlp41基因crispr敲除結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌的獲?。簩nrlp41基因crispr敲除結(jié)構(gòu)(pbsbdcas9i-bnrlp41)通過電擊等方法轉(zhuǎn)化對(duì)油菜具有強(qiáng)侵染能力的農(nóng)桿菌菌株；

15、(3)轉(zhuǎn)bnrlp41基因crispr敲除結(jié)構(gòu)油菜的創(chuàng)制和獲?。和ㄟ^農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將bnrlp41基因crispr敲除結(jié)構(gòu)導(dǎo)入油菜，獲取轉(zhuǎn)bnrlp41基因crispr敲除結(jié)構(gòu)的油菜；

16、(4)轉(zhuǎn)bnrlp41基因crispr敲除結(jié)構(gòu)油菜純合系的獲?。阂钥股乜剐院Y選，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株后代的性狀分離情況，獲取后代性狀不再分離的、并能穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)bnrlp41基因crispr敲除結(jié)構(gòu)的油菜純合系；

17、(5)菌核病抗性減弱的轉(zhuǎn)bnrlp41基因crispr敲除結(jié)構(gòu)油菜純合系的篩選鑒定和獲?。阂赞D(zhuǎn)bnrlp41基因crispr敲除結(jié)構(gòu)(pbsbdcas9i-bnrlp41)的油菜純合系為材料，檢測(cè)分析對(duì)菌核病的抗性，獲取菌核病抗性減弱的bnrlp41基因crispr敲除油菜。

18、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明提供的bnrlp41基因是優(yōu)質(zhì)抗菌核病基因資源，利用該基因獲取的抗病材料具有抗病性較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。油菜菌核病抗性是數(shù)量性狀抗性，由多基因控制。一般而言，單個(gè)基因?qū)υ摽剐缘恼{(diào)控程度較低。因此，全世界范圍內(nèi)，油菜菌核病抗性材料都很匱乏，尚無高抗材料。bnrlp41基因編碼類受體蛋白，是識(shí)別病原分子模式的受體基因，抗性激發(fā)效果好，因而是優(yōu)質(zhì)抗病基因資源。利用rlp創(chuàng)制抗病品種和種質(zhì)是病害綠色防控的經(jīng)濟(jì)有效和安全的途徑。因此，bnrlp41基因是一種適用于創(chuàng)制和選育抗菌核病油菜新材料和新品種的全新基因資源。(2)獲取抗病材料周期短。獲取抗病植物材料和品種的方法主要有常規(guī)的傳統(tǒng)育種方法和利用抗病調(diào)控基因的基因工程育種方法。傳統(tǒng)育種方法具有可用抗病資源范圍受天然遺傳隔離限制，選育周期長(zhǎng)，需要大量人工物力等缺點(diǎn)。而基因工程育種方法則具有可用抗病資源范圍廣、操作相對(duì)簡(jiǎn)單方便、培育周期短、無需大量人工物力、特別適宜培育廣譜、持久、高抗病性品種等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明利用抗病調(diào)控基因bnrlp41，采用基因工程方法，創(chuàng)制培育高抗菌核病的油菜材料，具有周期短，選育快速等特點(diǎn)。