本發(fā)明屬于絲素蛋白加工，具體涉及一種絲素抗氧化肽的固定化酶的制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、繭絲作為一種天然纖維材料，是人類最早利用的動(dòng)物纖維之一。其結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)含量較高，主要包括絲素蛋白和絲膠蛋白，其中絲素蛋白的含量占繭絲的70％左右，構(gòu)成了繭絲的基本結(jié)構(gòu)(絲綢,2022,59(12):1-7.)。我國(guó)是絲綢生產(chǎn)大國(guó)，擁有豐富的下腳繭和廢絲資源。然而，目前對(duì)這些資源的深度加工還相對(duì)有限，導(dǎo)致資源的利用率不高。

2、隨著科技的進(jìn)步，繭絲不僅僅聚焦于紡織、生物材料等領(lǐng)域(cn202210258571.x)，在營(yíng)養(yǎng)方面，絲素蛋白因其豐富的蛋白含量和良好的生物相容性，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。然而，絲素本身具有難溶于水的性質(zhì)，它不能直接被人體吸收，只能將絲素蛋白水解成多肽或者低聚肽，這樣人體對(duì)它的營(yíng)養(yǎng)吸收程度才會(huì)有所上升(cn201911204150.3)。絲素蛋白富含18種氨基酸，絲素蛋白因其良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理活性，在營(yíng)養(yǎng)保健食品中得到廣泛應(yīng)用(cn201820477314.4)。絲素蛋白含有豐富的氨基酸，特別是人體必需的氨基酸，如賴氨酸和蘇氨酸(process?biochemistry,134(2):1-16)，研究表明絲素蛋白可以被添加到飼料中，可將絲素蛋白作為飼料中的主要營(yíng)養(yǎng)成分，增加其生物轉(zhuǎn)化以及利用率(cn201810880725.2)。因此，絲素蛋白成為一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑，常被添加到蛋白粉、能量棒、營(yíng)養(yǎng)飲料等產(chǎn)品中，以增加其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

3、絲素肽是由天然絲素蛋白經(jīng)過水解或酶解得到的多肽物質(zhì)，絲素肽因其豐富的氨基酸組成和生理活性，在營(yíng)養(yǎng)保健食品中得到廣泛應(yīng)用(中國(guó)調(diào)味品,2022,47(12):26-31.)。絲素肽富含多種生理活性肽段，如抗氧化肽、抗菌肽等，可以提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性(cn201811621708.3，foodchemistry,2021,367:130647.)，也可以被添加到乳制品、谷物制品、保健食品等產(chǎn)品中，增強(qiáng)其功能性，改善產(chǎn)品的口感和營(yíng)養(yǎng)特性。此外，絲素肽具有良好的功能性質(zhì)，如乳化性、凝膠性和穩(wěn)定性，可以作為食品原料進(jìn)行利用(foodbioscience,54,102897)。隨著人們對(duì)功能性食品和營(yíng)養(yǎng)保健品需求的不斷提升，絲素肽作為一種具有多種生理活性的食品成分，將繼續(xù)發(fā)揮重要作用，并在未來的食品創(chuàng)新中發(fā)揮更大的潛力。其中，絲素抗氧化肽在食品添加中發(fā)揮重要作用，主要體現(xiàn)在其強(qiáng)大的抗氧化性能和對(duì)食品質(zhì)量的保護(hù)作用。作為一種天然的抗氧化劑，絲素抗氧化肽可以有效清除自由基和活性氧分子，延緩食品的氧化反應(yīng)，從而延長(zhǎng)食品的保鮮期、改善色澤和口感，并保持食品中的營(yíng)養(yǎng)成分(process?biochemistry,2023,134(1):218-231.)。此外，絲素抗氧化肽還能有效抑制食品中脂質(zhì)的氧化，提高食品的穩(wěn)定性和質(zhì)量，符合現(xiàn)代消費(fèi)者對(duì)健康、安全和高品質(zhì)食品的需求。因此，將絲素抗氧化肽添加到食品中可以為食品工業(yè)帶來顯著的益處，是一種具有廣闊應(yīng)用前景的食品添加劑。

4、借助蛋白酶催化絲素蛋白，可促進(jìn)蛋白質(zhì)在酶切位點(diǎn)酶解獲取絲素肽。有研究將絲素蛋白利用蛋白酶進(jìn)行酶解得到小分子絲素肽，與現(xiàn)有的技術(shù)相比更加高效節(jié)能，肽產(chǎn)率可達(dá)95.5％(cn202210636182.6)。研究也證明了采用舍雷肽酶水解絲素在獲取絲素肽方面具有水解速度快、水解度易控制的優(yōu)點(diǎn)，并且制備出的絲素肽具有抗氧化活性(cn201811621708.3)。此外，先前研究也證實(shí)了采用中性蛋白酶對(duì)絲素溶液進(jìn)行酶解實(shí)現(xiàn)了絲素肽產(chǎn)品的獲取，并且肽含量達(dá)到94％(cn201310208901.5)。

5、蛋白酶雖然被普遍應(yīng)用于獲取小分子肽，但游離酶的耐酸堿能力弱，容易出現(xiàn)自溶或者自聚的現(xiàn)象。隨著技術(shù)的進(jìn)步，單獨(dú)依靠自然酶來進(jìn)行反應(yīng)已經(jīng)無法滿足當(dāng)今工業(yè)的需求，然而，傳統(tǒng)的酶解方法無法對(duì)酶進(jìn)行分離回收并重復(fù)利用，限制了其實(shí)際應(yīng)用(environmental?research,2023,237(2),117023)。固定化酶是一種利用化學(xué)或物理手段將酶分子固定在表面或空間中，以維持其特定的催化活性，同時(shí)又可以被反復(fù)利用的技術(shù)(international?journal?of?biological?macromolecules,2023,253(6),127358.)。在酶工程領(lǐng)域，固定化酶具有重要的研究?jī)r(jià)值。固定化酶可利用載體的保護(hù)作用，促進(jìn)酶在強(qiáng)酸強(qiáng)堿、高溫或有機(jī)溶劑中能保持活性，提高酶的穩(wěn)定性(cn201610145659.5，european?foodresearch?and?technology,2021,247(2):343-352.)。此外，依靠過濾等簡(jiǎn)單的方法達(dá)到酶與產(chǎn)物分離的效果，實(shí)現(xiàn)酶的分離、回收效率的提高，讓它具備可重復(fù)使用性，還可以憑借載體特有的親疏水性性質(zhì)，結(jié)合反應(yīng)環(huán)境的調(diào)控，提高酶的催化性能。與游離酶相比，固定化酶易于精確控制反應(yīng)細(xì)節(jié)，因此它在化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)等領(lǐng)域被不斷嘗試創(chuàng)新應(yīng)用。

6、目前，國(guó)內(nèi)已有研究團(tuán)隊(duì)關(guān)注了絲素肽資源的開發(fā)利用，固定化酶的水解方式也發(fā)展迅速。有研究在中空纖維管上固定化蛋白酶，制備固定化酶與層析色譜聯(lián)用，應(yīng)用于膠原蛋白肽、蠶絲蛋白肽等蛋白肽的生產(chǎn)中(cn202122045959.5)。固定化酶技術(shù)的引入為酶的應(yīng)用提供了更多可能性，為實(shí)現(xiàn)絲素肽工業(yè)化高效生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。然而，以上研究主要集中于獲得抗氧化肽、ace抑制肽、膠原蛋白肽等方面，以可食用的海藻酸鈉作為原料進(jìn)行酶的固定化并水解絲素蛋白的研究鮮見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種絲素抗氧化肽的固定化酶的制備方法與應(yīng)用，通過優(yōu)化固定化酶的制備工藝，高效制備出具有抗氧化活性的絲素肽，對(duì)酶解前后絲素肽進(jìn)行表征分析，為拓寬絲素肽應(yīng)用領(lǐng)域提供依據(jù)。同時(shí)，開發(fā)添加絲素肽的可食化產(chǎn)品，拓寬了絲素肽加工的應(yīng)用領(lǐng)域，為進(jìn)一步延伸蠶桑產(chǎn)業(yè)鏈提供了理論依據(jù)，為絲素活性肽新型高值產(chǎn)品開發(fā)提供新思路。

2、為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

3、一種絲素抗氧化肽的固定化酶法制備方法，包括以下步驟：第一步，選取蛋白酶，并測(cè)定酶活；第二步，向蛋白酶中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-10％的海藻酸鈉、1-10％的氯化鈣濃度、1-50u/ml蛋白酶，磁力攪拌1-10h后得到固定化酶

4、優(yōu)選的，第一步中所述蛋白酶為風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶或木瓜蛋白酶。

5、優(yōu)選的，第二步中海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.4％；所述氯化鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.82％；所述蛋白酶的添加量為21.75u/ml。

6、上述制備方法制備得到的固定化酶在水解絲素蛋白溶液制備絲素抗氧化肽上的應(yīng)用。

7、優(yōu)選的是，所述應(yīng)用，包括以下步驟：

8、步驟1，采用na2co3沸水浴法將干蠶繭脫膠得到絲素蛋白，再經(jīng)1-10kda的透析袋透析出ca2+，并凍干備用；

9、步驟2，用去離子水復(fù)溶凍干后的絲素蛋白至1-100g/l，采用1mol/lnaoh和1mol/lhcl調(diào)節(jié)溶液的ph至7-9，且在20-70℃的反應(yīng)條件下加入固定化酶，再調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的ph至7-9，酶解0.5-6h，得到絲素抗氧化肽。

10、優(yōu)選的，步驟1中所述透析袋截留分子量為8kda。

11、優(yōu)選的，步驟2中固定化酶的活力為20.25u/mg。

12、優(yōu)選的，步驟2中反應(yīng)體系中ph為8.5、溫度為40℃、反應(yīng)時(shí)間為2h。

13、上述絲素抗氧化肽作為添加劑在制備果凍上的應(yīng)用。

14、優(yōu)選的是，制備果凍的步驟為：取1-50ml絲素抗氧化肽溶液液與1-200ml果汁液按體積比為1:(1-10)充分混合后，加入1-50g白涼粉，攪拌充分，加熱1-30min后，倒入模具中，放入冰箱冷藏1-120min，得到絲素肽果凍。

15、有益效果：

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明一種絲素抗氧化肽的固定化酶的制備方法與應(yīng)用，通過優(yōu)化固定化酶的制備工藝參數(shù)，以高效制備具有抗氧化活性的絲素肽，進(jìn)而開發(fā)添加絲素肽的可食化產(chǎn)品，拓寬了絲素肽加工的應(yīng)用領(lǐng)域，為進(jìn)一步延伸蠶桑產(chǎn)業(yè)鏈提供了理論依據(jù)，為絲素活性肽新型高值產(chǎn)品開發(fā)提供新思路。具體優(yōu)勢(shì)如下：

17、1、本發(fā)明針對(duì)游離酶易失活和重復(fù)利用率不高等問題，開發(fā)以海藻酸鈉為原料的固定化蛋白酶關(guān)鍵技術(shù)，以提升蛋白酶的重復(fù)利用度。

18、2、本發(fā)明針對(duì)絲素蛋白不易消化吸收的問題，開發(fā)固定化酶水解絲素蛋白得到具有抗氧化活性的小分子絲素肽，提升絲素蛋白的資源利用率，為活性肽的獲取提供理論依據(jù)。

19、3、本發(fā)明針對(duì)絲素抗氧化肽資源利用率低的問題，制備出添加絲素肽溶液的可食用果凍新產(chǎn)品，以擴(kuò)大絲素肽的資源應(yīng)用領(lǐng)域。