本發(fā)明屬于生物，具體涉及保護b群腦膜炎球菌感染的外膜囊泡組合物及制法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、腦膜炎奈瑟菌為一種革蘭陰性雙球菌，人是唯一的自然宿主，通常定植在人的鼻咽部。流行性腦脊髓膜炎是由腦膜炎奈瑟菌(或稱腦膜炎球菌)neisseria?meningitidis感染引起的一種全球性嚴(yán)重呼吸道傳染病。在過去一百多年來，常在世界范圍內(nèi)引起周期性流行或散在發(fā)生流腦疫情，具有較高的發(fā)病率和病死率。根據(jù)細菌表面莢膜多糖的結(jié)構(gòu)和抗原性差異，將其分為13個不同的血清群，其中多數(shù)病例是由a、b、c、w135和y群菌株引起的。

2、腦膜炎球菌細胞外膜是由外膜蛋白(omp)、脂蛋白及脂寡糖(lipooligosaccharide，los)組成的高分子復(fù)合物，在自然狀態(tài)下成囊泡狀結(jié)構(gòu)，又稱為外膜囊泡(omv)，其中主要具有免疫原性為

3、外膜蛋白。b群流腦菌株具有多樣的表型和基因型特征，但往往引起爆發(fā)或流行的b群菌株可能屬于某一個優(yōu)勢的克隆群。所以，單價omv疫苗很難保護和抵抗所有不同b群流腦菌株導(dǎo)致的疾病。

4、目前，人們在如何通過基因工程開發(fā)具有保護b群腦膜炎球菌感染的突變株方面，尚未研究清楚，由此使得開發(fā)具有高效保護b群腦膜炎球菌感染的突變株外膜囊泡方面的研究進展緩慢。因此，在此基礎(chǔ)上開發(fā)相應(yīng)的外膜囊泡組合物，更顯得困難。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種保護b群腦膜炎球菌感染的外膜囊泡組合物，該組合物的各組分在保護b群腦膜炎球菌感染方面具有協(xié)同作用。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

3、一種保護b群腦膜炎球菌感染的外膜囊泡組合物，所述外膜囊泡組合物由脂多糖修飾b群腦膜炎球菌的外膜囊泡和表達重組蛋白的b群腦膜炎球菌的外膜囊泡組成；

4、所述脂多糖修飾b群腦膜炎球菌的分類命名為奈瑟氏球菌neisseria?sp.，保藏號為cgmccno.36402，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏時間為2024年7月19日；

5、所述表達重組蛋白的b群腦膜炎球菌的分類命名為腦膜炎奈瑟氏球菌neisseriameningitidis，保藏號為cgmcc?no.31404，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏時間為2024年7月30日。

6、所述脂多糖修飾b群腦膜炎球菌是對b群腦膜炎球菌敲除lpta基因后在該基因處過表達lpxe基因后所得；

7、所述表達重組蛋白的b群腦膜炎球菌通過自轉(zhuǎn)運系統(tǒng)hbp表達重組蛋白neisserial?heparin?binding?antigen(nhba)、fhbp和neisseria?adhesin?a(nada)。

8、所述表達重組蛋白的b群腦膜炎球菌由以下方法制備而得：

9、(1)利用hbp蛋白自轉(zhuǎn)運系統(tǒng)將nhba、fhbp和nada抗原的基因表達片段構(gòu)建于質(zhì)粒中；

10、(2)將質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)入b群腦膜炎球菌背景菌株中；

11、所述質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括如下步驟：

12、1)將來源于b群腦膜炎球菌自身的hbp自轉(zhuǎn)運系統(tǒng)表達盒利用gibson?assemblykit組裝試劑盒一步法克隆至載體pya3332中；

13、2)利用gibson?assembly?kit組裝試劑盒將b群腦膜炎球菌抗原重組蛋白nhba、fhbp和nada的編碼基因序列分別克隆至hbp自轉(zhuǎn)運系統(tǒng)表達盒中，以實現(xiàn)將三種抗原表達至b群腦膜炎球菌外膜表面；

14、hbp自轉(zhuǎn)運系統(tǒng)表達質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法包括如下步驟：

15、1)引物設(shè)計：

16、hbp-f:5’ctgaccttggacgcgccaccggtttaag3’

17、hbp-r:5’aaccttgcgcgatgagcataagcgtacagcctg?3’

18、2)提取處于對數(shù)生長期的b群腦膜炎奈瑟菌基因組dna作為模板，以及以pya3332線性化質(zhì)粒作為模板分別用對應(yīng)引物進行擴增，分別得到對應(yīng)片段的擴增產(chǎn)物，利用gibson?assembly?kit進行一步法克隆，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株top10中，得到重組質(zhì)粒pya3332-hbp；

19、所述nhba、fhbp和nada抗原的表達質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括如下步驟：

20、1)引物設(shè)計：

21、nhba-f:5’tgctgacaaagaactgggatgtttgaacgcagtgtgattg3’

22、nhba-r:5’gaaacagttcctgagtctcaatcctgctctttttt3’

23、fhbp-f:5’tgccaccctgagtctgaacaggtgaaccgaactgccttctgctgc3’

24、fhbp-r:5’cgctgttacgacgcattgagattattgcttggcttcaagacc3’

25、nada-f:5’tgccaccctgagtctgaacagcatgcaaaccgccgccgccgctc3’nada-r:5’cgctgttacgacgcattgagactcaggcgggtcccatgcc3’

26、pya3332-hbp-nhba-f:5’caatcacactgcgtttgacgtaactgacgattgc3’

27、pya3332-hbp-nhba-r:5’aaaaagagcaggattgcagtaaaccttggcgacgtg3’

28、pya3332-hbp-fhbp-f:5’gcagcagaaggcagagcgccggcctgaaggtaatc3’

29、pya3332-hbp-fhbp-r:5’ggtcttgaagccaagctgcgccgagagcgattga3’

30、pya3332-hbp-nada-f:5’gagcggcggcggcggttaagcgccggcctgaaggta?atc3’

31、pya3332-hbp-nada-r:5’ggcatgggacccgcctgagcgccgagagcgattga3’

32、2)利用引物nhba-f和nhba-r以b群腦膜炎奈瑟菌為模板擴增nhba對應(yīng)的序列，利用引物pya3332-hbp-nhba-f和pya3332-hbp-nhba-r以pya3332-hbp為模板擴增載體片段，分別得到對應(yīng)片段的擴增產(chǎn)物，利用gibson?assembly?kit進行一步法克隆，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株top10中，得到重組質(zhì)粒pya3332-hbp-nhba；

33、3)利用引物fhbp-f和fhbp-r以b群腦膜炎奈瑟菌為模板擴增fhbp對應(yīng)的序列，利用引物pya3332-hbp-fhbp-f和pya3332-hbp-fhbp-r以pya3332-hbp-nhba為模板擴增載體片段，分別得到對應(yīng)片段的擴增產(chǎn)物，利用gibson?assembly?kit進行一步法克隆，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株top10中，得到重組質(zhì)粒pya3332-hbp-nhba-fhbp；

34、4)利用引物nada-f和nada-r以b群腦膜炎奈瑟菌為模板擴增fhbp對應(yīng)的序列，利用引物pya3332-hbp-nada-f和pya3332-hbp-nada-r以pya3332-hbp-nhba-fhbp為模板擴增載體片段，分別得到對應(yīng)片段的擴增產(chǎn)物，利用gibson?assembly?kit進行一步法克隆，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株top10中，得到重組質(zhì)粒pya3332-hbp-nhba-fhbp-nada。

35、具體地，所述脂多糖修飾b群腦膜炎球菌，是通過同源重組的方法，將強制表達磷酸基團合酶lpxe的基因lpxe構(gòu)建至敲除lpta基因的上下游同源臂之間，形成敲除lpta同時表達lpxe的基因型，得到具有可高效激活tlr4受體的最優(yōu)lipid?a結(jié)構(gòu)的b群腦膜炎球菌突變株；

36、所述同源重組過程中，所用的質(zhì)粒pre112-lpta/ptrc-lpxe的構(gòu)建方法如下：

37、根據(jù)genbank上序列號為nz_lr134326.1的基因序列，設(shè)計在lpta同源臂中間插入lpxe序列，引物如下：

38、lpta-3f：5’tgagacgctgacgataattgc3’

39、lpta-3r：5’cgatgaaatttgcgcgatgacg3’

40、lpxe-1f：5’ccgagactttgacgtagacgtgacgtgacgatgacg3’

41、lpxe-1r：5’cgacgatagcgatgacgattgacgattaaccgt3’；

42、提取處于對數(shù)生長期的bordetella?bronchiseptica參考菌株的基因組dna作為模板，分別利用lpxe-1f和lpxe-1r擴增lpxe全長片段，隨后以pre112-lpta質(zhì)粒為模板，利用lpta-3f和lpta-3r擴增產(chǎn)物，隨后將兩段pcr產(chǎn)物利用一步法克隆方法，將反應(yīng)產(chǎn)物電轉(zhuǎn)入大腸桿菌工程菌感受態(tài)χ7232中，得到重組質(zhì)粒pre112-lpta/ptrc-lpxe。

43、優(yōu)選地，所述脂多糖修飾b群腦膜炎球菌的外膜囊泡和表達重組蛋白的b群腦膜炎球菌的外膜囊泡的重量比為2:1。

44、本發(fā)明還提供了上述外膜囊泡組合物的制備方法，所述外膜囊泡組合物是將上述脂多糖修飾b群腦膜炎球菌的外膜囊泡和表達重組蛋白的b群腦膜炎球菌的外膜囊泡混合而得。

45、本發(fā)明還提供了上述組合物在制備保護b群腦膜炎球菌感染藥物方面的應(yīng)用。具體地，所述組合物作為保護b群腦膜炎球菌感染的疫苗使用。

46、如本發(fā)明的實施例所示，在制備脂多糖修飾b群腦膜炎球菌時，僅敲除lipid?a合成相關(guān)基因lpta或者敲除lpta同時表達pagl的突變株所得的外膜囊泡所產(chǎn)生的免疫保護水平均明顯差于本發(fā)明所得菌株的外膜囊泡。本發(fā)明在所得脂多糖修飾b群腦膜炎球菌的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)將本發(fā)明的表達重組蛋白的b群腦膜炎球菌的外膜囊泡與脂多糖修飾b群腦膜炎球菌的外膜囊泡進行組合，可以顯著的增強保護b群腦膜炎球菌感染的效果。因此，本發(fā)明極大的提高了脂多糖修飾b群腦膜炎球菌的使用價值。

47、本發(fā)明的有益效果：

48、本發(fā)明所提供的外膜囊泡組合物，相對于單菌株的外膜囊泡而言，具有更好的保護b群腦膜炎球菌感染的效果，更適于作為疫苗使用。