本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種用于檢測(cè)非洲豬瘟病毒p72蛋白的膠體金檢測(cè)卡。

背景技術(shù)：

1、非洲豬瘟病毒(african?swine?fever?virus,asfv)是非洲豬瘟病毒科(asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(asfivirus)的唯一成員，也是目前已知唯一的蟲(chóng)媒雙鏈dna病毒。根據(jù)病毒血凝素cd2樣蛋白(cd2v)和c型凝集素(ep153r)可將已知的asfv劃分為八種血清型?；诰幋aasfv主要衣殼蛋白p72的b646l基因c端的478bp堿基可將其分為24個(gè)基因型。已知24個(gè)基因型的asfv在非洲均有分布。截至目前，只有基因i型和基因ii型的asfv傳播至非洲以外的地區(qū)，且基因ii型asfv是當(dāng)前全球流行的主要毒株。asfv是有囊膜的雙鏈線性dna病毒，成熟的asfv粒子呈直徑為260nm-300nm的球狀，組成部分主要有五部分：外部包膜、病毒衣殼、內(nèi)部包膜、核殼、核仁。asfv基因組由位于正二十面體衣殼內(nèi)的大小為170-194kb的雙股線性dna分子組成，編碼151-167個(gè)開(kāi)放閱讀框，可表達(dá)多種蛋白。asf是一種以高致病性，高死亡率和嚴(yán)重出血熱為特點(diǎn)的疾病。非洲豬瘟的爆發(fā)給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了毀滅性的打擊，造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前，仍無(wú)有效商業(yè)化的疫苗和藥物用于防治該疾病，asf防控策略仍側(cè)重于及早發(fā)現(xiàn)、限制牲畜活動(dòng)以及撲殺可能感染的畜群等生物安全措施。2018年，首例非洲豬瘟在我國(guó)確診，基因ii型強(qiáng)毒株成為國(guó)內(nèi)主要流行株。2020年首次報(bào)道基因ⅱ型中等毒力株，局部區(qū)域流行。隨后，基因ⅰ型低毒力株出現(xiàn)，局部區(qū)域流行。2021年首次發(fā)現(xiàn)基因ⅰ/ii型重組強(qiáng)毒株，現(xiàn)已成為優(yōu)勢(shì)流行株。多種毒株的出現(xiàn)使得中國(guó)非洲豬瘟疫情更加復(fù)雜，為非瘟防控帶來(lái)全新挑戰(zhàn)。

2、截至目前，國(guó)內(nèi)仍無(wú)有效的商品化疫苗，因此，快速有效的診斷方法對(duì)非洲豬瘟的防控至關(guān)重要。非洲豬瘟病毒檢測(cè)需要合適的樣本采集、保存，以及可靠的檢測(cè)方法?？乖瓩z測(cè)可針對(duì)病毒蛋白或病毒核酸；抗體檢測(cè)是針對(duì)病毒特異性抗體。當(dāng)前常用的抗原檢測(cè)方法為qpcr檢測(cè)，可檢測(cè)家豬、野豬、軟蜱以及環(huán)境中的任何一種臨床樣本中的asfv基因組，但操作繁瑣、需要昂貴的實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀器設(shè)備和專(zhuān)業(yè)人員，基層應(yīng)用受到嚴(yán)重限制；抗體檢測(cè)以elisa為代表，可高通量檢測(cè)豬體內(nèi)asfv特異性抗體水平，但仍存在操作繁瑣、需要酶標(biāo)儀和恒溫箱等設(shè)備，現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)受到限制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、隨著膠體金免疫層析技術(shù)的迅速發(fā)展，其展現(xiàn)出巨大的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，解決了實(shí)際生活中病毒檢測(cè)流程復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)、高損耗的問(wèn)題。本發(fā)明研發(fā)了快速檢測(cè)、操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、不需要專(zhuān)業(yè)設(shè)備的膠體金試紙條。

2、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明第一方面提供了一種雜交瘤細(xì)胞，所述雜交瘤細(xì)胞為第一雜交瘤細(xì)胞，第二雜交瘤細(xì)胞或者所述第一雜交瘤細(xì)胞與所述第二雜交瘤細(xì)胞的組合；

3、所述第一雜交瘤細(xì)胞為微生物保藏編號(hào)為cctcc?no:c2024210的雜交瘤細(xì)胞或者微生物保藏編號(hào)為cctcc?no:c2024210的雜交瘤細(xì)胞的傳代細(xì)胞；所述微生物保藏編號(hào)為cctcc?no:c2024210的雜交瘤細(xì)胞的傳代細(xì)胞分泌的單克隆抗體保持對(duì)非洲豬瘟病毒p72蛋白的特異性結(jié)合活性；

4、所述第二雜交瘤細(xì)胞為微生物保藏編號(hào)為cctcc?no:c2024212的雜交瘤細(xì)胞或者微生物保藏編號(hào)為cctcc?no:c2024212的雜交瘤細(xì)胞的傳代細(xì)胞；所述微生物保藏編號(hào)為cctcc?no:c2024212的雜交瘤細(xì)胞的傳代細(xì)胞分泌的單克隆抗體保持對(duì)非洲豬瘟病毒p72蛋白的特異性結(jié)合活性。

5、本發(fā)明第二方面提供了一種生物材料，所述生物材料是如下p1、p2、p3、p4、p5、p6、p7、p8、p9和p10中的任一種；

6、p1：?jiǎn)慰寺】贵w

7、所述單克隆抗體為第一單克隆抗體，第二單克隆抗體或者所述第一單克隆抗體與所述第二單克隆抗體的組合；

8、所述第一單克隆抗體保持對(duì)非洲豬瘟病毒p72蛋白的特異性結(jié)合活性；

9、所述第一單克隆抗體包括第一單克隆抗體重鏈和第一單克隆抗體輕鏈；

10、所述第一單克隆抗體重鏈包括第一單克隆抗體重鏈cdr1、第一單克隆抗體重鏈cdr2和第一單克隆抗體重鏈cdr3；

11、所述第一單克隆抗體輕鏈包括第一單克隆抗體輕鏈cdr1、第一單克隆抗體輕鏈cdr2和第一單克隆抗體輕鏈cdr3；

12、所述第一單克隆抗體重鏈cdr1蛋白序列如seq?id?no.3所示；

13、所述第一單克隆抗體重鏈cdr2蛋白序列如seq?id?no.5所示；

14、所述第一單克隆抗體重鏈cdr3蛋白序列如seq?id?no.7所示；

15、所述第一單克隆抗體輕鏈cdr1蛋白序列如seq?id?no.9所示；

16、所述第一單克隆抗體輕鏈cdr2蛋白序列如seq?id?no.11所示；

17、所述第一單克隆抗體輕鏈cdr3蛋白序列如seq?id?no.13所示；

18、所述第二單克隆抗體保持對(duì)非洲豬瘟病毒p72蛋白的特異性結(jié)合活性；

19、所述第二單克隆抗體包括第二單克隆抗體重鏈和第二單克隆抗體輕鏈；

20、所述第二單克隆抗體重鏈包括第二單克隆抗體重鏈cdr1、第二單克隆抗體重鏈cdr2和第二單克隆抗體重鏈cdr3；

21、所述第二單克隆抗體輕鏈包括第二單克隆抗體輕鏈cdr1、第二單克隆抗體輕鏈cdr2和第二單克隆抗體輕鏈cdr3；

22、所述第二單克隆抗體重鏈cdr1蛋白序列如seq?id?no.15所示；

23、所述第二單克隆抗體重鏈cdr2蛋白序列如seq?id?no.17所示；

24、所述第二單克隆抗體重鏈cdr3蛋白序列如seq?id?no.19所示；

25、所述第二單克隆抗體輕鏈cdr1蛋白序列如seq?id?no.21所示；

26、所述第二單克隆抗體輕鏈cdr2蛋白序列如seq?id?no.23所示；

27、所述第二單克隆抗體輕鏈cdr3蛋白序列如seq?id?no.25所示；

28、p2：?jiǎn)慰寺】贵w重鏈與單克隆抗體輕鏈組合

29、所述單克隆抗體重鏈與單克隆抗體輕鏈組合包括單克隆抗體重鏈與單克隆抗體輕鏈組合1、單克隆抗體重鏈與單克隆抗體輕鏈組合2或單克隆抗體重鏈與單克隆抗體輕鏈組合1和單克隆抗體重鏈與單克隆抗體輕鏈組合2的組合；

30、所述單克隆抗體重鏈與單克隆抗體輕鏈組合1保持對(duì)非洲豬瘟病毒p72蛋白的特異性結(jié)合活性；

31、所述單克隆抗體重鏈與單克隆抗體輕鏈組合1包括第一單克隆抗體重鏈和第一單克隆抗體輕鏈；

32、所述第一單克隆抗體重鏈包括第一單克隆抗體重鏈cdr1、第一單克隆抗體重鏈cdr2、第一單克隆抗體重鏈cdr3與功能性蛋白片段或惰性蛋白片段的氨基酸序列；

33、所述第一單克隆抗體輕鏈包括第一單克隆抗體輕鏈cdr1、第一單克隆抗體輕鏈cdr2、第一單克隆抗體輕鏈cdr3與功能性蛋白片段或惰性蛋白片段的氨基酸序列；

34、所述第一單克隆抗體重鏈cdr1蛋白序列如seq?id?no.3所示；

35、所述第一單克隆抗體重鏈cdr2蛋白序列如seq?id?no.5所示；

36、所述第一單克隆抗體重鏈cdr3蛋白序列如seq?id?no.7所示；

37、所述第一單克隆抗體輕鏈cdr1蛋白序列如seq?id?no.9所示；

38、所述第一單克隆抗體輕鏈cdr2蛋白序列如seq?id?no.11所示；

39、所述第一單克隆抗體輕鏈cdr3蛋白序列如seq?id?no.13所示；

40、所述單克隆抗體重鏈與單克隆抗體輕鏈組合2保持對(duì)非洲豬瘟病毒p72蛋白的特異性結(jié)合活性；

41、所述單克隆抗體重鏈與單克隆抗體輕鏈組合2包括第二單克隆抗體重鏈和第二單克隆抗體輕鏈；

42、所述第二單克隆抗體重鏈包括第二單克隆抗體重鏈cdr1、第二單克隆抗體重鏈cdr2、第二單克隆抗體重鏈cdr3與功能性蛋白片段或惰性蛋白片段的氨基酸序列；

43、所述第二單克隆抗體輕鏈包括第二單克隆抗體輕鏈cdr1、第二單克隆抗體輕鏈cdr2、第二單克隆抗體輕鏈cdr3與功能性蛋白片段或惰性蛋白片段的氨基酸序列；

44、所述第二單克隆抗體重鏈cdr1蛋白序列如seq?id?no.15所示；

45、所述第二單克隆抗體重鏈cdr2蛋白序列如seq?id?no.17所示；

46、所述第二單克隆抗體重鏈cdr3蛋白序列如seq?id?no.19所示；

47、所述第二單克隆抗體輕鏈cdr1蛋白序列如seq?id?no.21所示；

48、所述第二單克隆抗體輕鏈cdr2蛋白序列如seq?id?no.23所示；

49、所述第二單克隆抗體輕鏈cdr3蛋白序列如seq?id?no.25所示；

50、p3：抗體衍生物

51、所述抗體衍生物的形式選自：酶標(biāo)抗體、熒光標(biāo)記抗體、化學(xué)修飾抗體、抗體fab片段、豬源化抗體、單鏈抗體、嵌合單克隆抗體和改型單克隆抗體；

52、所述抗體衍生物為第一抗體衍生物，第二抗體衍生物或者所述第一抗體衍生物與所述第二抗體衍生物的組合；

53、所述第一抗體衍生物保持對(duì)非洲豬瘟病毒p72蛋白的特異性結(jié)合活性；

54、所述抗體衍生物的蛋白序列部分含有第一單克隆抗體重鏈cdr1、第一單克隆抗體重鏈cdr2、第一單克隆抗體重鏈cdr3、第一單克隆抗體輕鏈cdr1、第一單克隆抗體輕鏈cdr2和第一單克隆抗體輕鏈cdr3；

55、所述第一單克隆抗體重鏈cdr1蛋白序列如seq?id?no.3所示；

56、所述第一單克隆抗體重鏈cdr2蛋白序列如seq?id?no.5所示；

57、所述第一單克隆抗體重鏈cdr3蛋白序列如seq?id?no.7所示；

58、所述第一單克隆抗體輕鏈cdr1蛋白序列如seq?id?no.9所示；

59、所述第一單克隆抗體輕鏈cdr2蛋白序列如seq?id?no.11所示；

60、所述第一單克隆抗體輕鏈cdr3蛋白序列如seq?id?no.13所示；

61、所述第二抗體衍生物保持對(duì)非洲豬瘟病毒p72蛋白的特異性結(jié)合活性；

62、所述抗體衍生物的蛋白序列部分含有第二單克隆抗體重鏈cdr1、第二單克隆抗體重鏈cdr2、第二單克隆抗體重鏈cdr3、第二單克隆抗體輕鏈cdr1、第二單克隆抗體輕鏈cdr2和第二單克隆抗體輕鏈cdr3；

63、所述第二單克隆抗體重鏈cdr1蛋白序列如seq?id?no.15所示；

64、所述第二單克隆抗體重鏈cdr2蛋白序列如seq?id?no.17所示；

65、所述第二單克隆抗體重鏈cdr3蛋白序列如seq?id?no.19所示；

66、所述第二單克隆抗體輕鏈cdr1蛋白序列如seq?id?no.21所示；

67、所述第二單克隆抗體輕鏈cdr2蛋白序列如seq?id?no.23所示；

68、所述第二單克隆抗體輕鏈cdr3蛋白序列如seq?id?no.25所示；

69、p4：rna組合

70、所述rna組合包括第一rna組合、第二rna組合或者所述第一rna組合與所述第二rna組合的組合；

71、所述第一rna組合包括第一單克隆抗體重鏈rna和第一單克隆抗體輕鏈rna；

72、所述第一單克隆抗體重鏈rna能夠被翻譯得到p1或p2中所述的第一單克隆抗體重鏈；

73、所述第一單克隆抗體輕鏈rna能夠被翻譯得到p1或p2中所述的第一單克隆抗體輕鏈；

74、所述第二rna組合包括第二單克隆抗體重鏈rna和第二單克隆抗體輕鏈rna；

75、所述第二單克隆抗體重鏈rna能夠被翻譯得到p1或p2中所述的第二單克隆抗體重鏈；

76、所述第二單克隆抗體輕鏈rna能夠被翻譯得到p1或p2中所述的第二單克隆抗體輕鏈；

77、p5：基因組合

78、所述基因組合包括第一基因組合、第二基因組合或所述第一基因組合與所述第二基因組合的組合；

79、所述第一基因組合的編碼序列能夠編碼p1或p2中所述的第一單克隆抗體重鏈以及p1或p2中所述的第一單克隆抗體輕鏈；

80、所述第二基因組合的編碼序列能夠編碼p1或p2中所述的第二單克隆抗體重鏈以及p1或p2中所述的第二單克隆抗體輕鏈；

81、p6：基因表達(dá)盒組合

82、所述基因表達(dá)盒組合包括第一基因表達(dá)盒組合、第二基因表達(dá)盒組合或者所述第一基因表達(dá)盒組合與所述第二基因表達(dá)盒組合的組合；

83、所述第一基因表達(dá)盒組合中的基因表達(dá)產(chǎn)物為p4中所述的第一rna組合；

84、所述第二基因表達(dá)盒組合中的基因表達(dá)產(chǎn)物為p4中所述的第二rna組合；

85、p7：基因工程載體

86、所述基因工程載體包括第一基因工程載體、第二基因工程載體或者所述第一基因工程載體與所述第二基因工程載體的組合；

87、所述第一基因工程載體中含有p6中所述的第一基因表達(dá)盒；

88、所述第一單克隆抗體重鏈rna和所述第一單克隆抗體輕鏈rna在一個(gè)或者兩個(gè)載體中編碼；

89、所述第二基因工程載體中含有p6中所述的第二基因表達(dá)盒；

90、所述第二單克隆抗體重鏈rna和所述第二單克隆抗體輕鏈rna在一個(gè)或者兩個(gè)載體中編碼；

91、p8：細(xì)胞

92、所述細(xì)胞包括第一細(xì)胞，第二細(xì)胞或者所述第一細(xì)胞和所述第二細(xì)胞的組合；

93、所述第一細(xì)胞中含有p7中所述的第一基因工程載體；

94、所述第一基因工程載體的基因表達(dá)盒中的編碼rna組成型表達(dá)或人工誘導(dǎo)型表達(dá)；

95、當(dāng)所述第一單克隆抗體重鏈rna和所述第一單克隆抗體輕鏈rna在兩個(gè)載體中編碼時(shí)，所述兩個(gè)載體在相同的細(xì)胞中或者不同的細(xì)胞中；

96、所述第二細(xì)胞中含有p7中所述的第二基因工程載體；

97、所述第二基因工程載體的基因表達(dá)盒中的編碼rna組成型表達(dá)或人工誘導(dǎo)型表達(dá)；

98、當(dāng)所述第二單克隆抗體重鏈rna和所述第二單克隆抗體輕鏈rna在兩個(gè)載體中編碼時(shí)，所述兩個(gè)載體在相同的細(xì)胞中或者不同的細(xì)胞中；

99、p9：組合物

100、所述組合物為第一組合物、第二組合物或者所述第一組合物與所述第二組合物的組合；

101、所述第一組合物中含有p1中所述的第一單克隆抗體，p2中所述的單克隆抗體重鏈與單克隆抗體輕鏈組合1，p3中所述的第一抗體衍生物，p4中所述的第一rna組合，p7中所述的第一基因工程載體或者p8中所述的第一細(xì)胞；

102、所述第二組合物中含有p1中所述的第二單克隆抗體，p2中所述的單克隆抗體重鏈與單克隆抗體輕鏈組合2，p3中所述的第二抗體衍生物，p4中所述的第二rna組合，p7中所述的第二基因工程載體或者p8中所述的第二細(xì)胞；以及

103、p10：試劑盒

104、所述試劑盒為第一試劑盒、第二試劑盒或者所述第一試劑盒與所述第二試劑盒的組合；

105、所述第一試劑盒中含有p1中所述的第一單克隆抗體，p2中所述的單克隆抗體重鏈與單克隆抗體輕鏈組合1，p3中所述的第一抗體衍生物，p4中所述的第一rna組合，p7中所述的第一基因工程載體或者p8中所述的第一細(xì)胞；

106、所述第二試劑盒中含有p1中所述的第二單克隆抗體，p2中所述的單克隆抗體重鏈與單克隆抗體輕鏈組合2，p3中所述的第二抗體衍生物，p4中所述的第二rna組合，p7中所述的第二基因工程載體或者p8中所述的第二細(xì)胞。

107、在一些實(shí)施方式中，選自如下c1、c2、c3、c4中的任一種或其組合：

108、c1：在p1中，所述第一單克隆抗體是權(quán)利要求1所述的第一雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體，和/或

109、所述第二單克隆抗體是權(quán)利要求1所述的第二雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體；

110、c2：在p2中，所述功能性蛋白片段為用于分離純化蛋白的標(biāo)簽肽和/或信號(hào)肽；

111、c3：所述非洲豬瘟病毒p72蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示；

112、c4：所述化學(xué)修飾抗體為膠體金標(biāo)記的抗體。

113、本發(fā)明第一方面所述的雜交瘤細(xì)胞或者本發(fā)明第二方面所述的生物材料在制備用于識(shí)別、檢測(cè)或鑒定非洲豬瘟病毒p72蛋白、含有非洲豬瘟病毒p72蛋白的非洲豬瘟病毒亞病毒顆?；蛘叻侵挢i瘟病毒顆粒的制劑中的用途。

114、在一些實(shí)施方式中，所述非洲豬瘟病毒p72蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

115、本發(fā)明第三方面提供了一種用于檢測(cè)生物物質(zhì)的檢測(cè)卡，所述檢測(cè)卡中含有膠體金墊和檢測(cè)線；

116、所述檢測(cè)卡為第一檢測(cè)卡或第二檢測(cè)卡；

117、在所述第一檢測(cè)卡中，所述膠體金墊中含有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體a，所述檢測(cè)線中含有單克隆抗體b；

118、所述單克隆抗體a為本發(fā)明第二方面中所述第一單克隆抗體和所述第二單克隆抗體中的任一種；所述單克隆抗體b為本發(fā)明第二方面中所述第一單克隆抗體和所述第二單克隆抗體中的另一種；

119、在所述第二檢測(cè)卡中，所述膠體金墊中含有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體c，所述檢測(cè)線中含有單克隆抗體d；或者所述膠體金墊中含有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體d，所述檢測(cè)線中含有單克隆抗體c；

120、所述單克隆抗體c為本發(fā)明第二方面中所述第一單克隆抗體或者所述第二單克隆抗體；所述單克隆抗體d是小鼠源抗非洲豬瘟病毒p72蛋白單克隆抗體igg，所述單克隆抗體d與本發(fā)明第二方面中所述第一單克隆抗體與所述第二單克隆抗體識(shí)別的抗非洲豬瘟病毒p72蛋白表位均不同；

121、所述生物物質(zhì)選自：

122、包含非洲豬瘟病毒p72蛋白的混合液；

123、包含非洲豬瘟病毒顆粒的混合液；

124、包含含有非洲豬瘟病毒p72蛋白的非洲豬瘟病毒亞病毒顆粒的混合液。

125、在一些實(shí)施方式中，所述檢測(cè)卡中還含有底板、樣品墊、透水膜、吸水墊和質(zhì)控線。

126、在一些實(shí)施方式中，在所述底板的一個(gè)側(cè)面上從一端到另一端依次設(shè)置所述樣品墊、所述膠體金墊、所述透水膜和所述吸水墊，所述質(zhì)控線和所述檢測(cè)線設(shè)置在所述透水膜上。

127、在一些實(shí)施方式中，在所述樣品墊和所述金標(biāo)墊之間還設(shè)置有濾血膜。

128、在一些實(shí)施方式中，選自如下s1、s2、s3、s4和s5中的任一種或其組合；

129、s1：所述非洲豬瘟病毒p72蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

130、s2：所述質(zhì)控線上設(shè)置有抗小鼠igg抗體；

131、s3：所述透水膜為硝酸纖維素膜；

132、s4：所述底板為pvc板；

133、s5：所述非洲豬瘟病毒的genbank號(hào)為mz945537.1或mw656282.1，或者

134、所述非洲豬瘟病毒的微生物保藏編號(hào)為保藏號(hào)為：cctcc?no:v201924。