本發(fā)明屬于生物，涉及一種膠體金標記的水凝膠聚合物納米顆粒，本發(fā)明還涉及所述膠體金標記的水凝膠聚合物納米顆粒的制備方法及其在sars-cov-2病毒檢測中的應用。

背景技術：

1、新型冠狀病毒(sars-cov-2)，簡稱“新冠病毒”，是繼sars-cov及mers-cov之后發(fā)現(xiàn)的第三種能夠引起嚴重急性呼吸系統(tǒng)疾病的高致病性β屬人冠狀病毒。作為一種嚴重的流行疾病，新冠病毒的快速診斷至關重要，其檢測方法主要包括病原學檢測法、分子生物學檢測法以及免疫學抗體、抗原檢測法?？乖瓩z測通常用于前期檢測疑似感染新冠病毒的患者，主要檢測新冠病毒結構蛋白核衣殼蛋白(nucleocapsid,n)或者刺突蛋白(spike,s)，兩種結構蛋白均為新冠病毒的特異性蛋白，檢測原理基于抗原抗體免疫反應或者是適配體雜交，采用比色、熒光、電化學等方式轉(zhuǎn)換成檢測信號。

2、側向?qū)游鰴z測是一個基于紙張層析的平臺，廣泛用于快速和現(xiàn)場檢測，其中基于抗原抗體免疫反應以實現(xiàn)檢測結果的可稱為測流免疫層析檢測。作為一種較為常見的抗原檢測方法，測流免疫層析檢測將免疫檢測和層析分離相結合，具有操作簡單、成本低廉、易于攜帶、即時診斷等優(yōu)點。膠體金，乳膠，銪，螯合負載的二氧化硅等有色試劑是側向?qū)游黾夹g常用的顏色檢測試劑，其中膠體金(金納米顆粒，au)最為常用，基于膠體金法的新冠病毒抗原檢測試劑盒就是新冠患者初期進行自我診斷的常見手段。膠體金抗原檢測試紙條組成包括載體、包被有檢測線(t線，含單克隆抗體)和質(zhì)控線(c線，含抗抗體)的硝酸纖維膜、用于承載金標抗體(膠體金標記單克隆抗體)的金標墊、用于承接樣品溶液的樣品墊以及用于引導樣品溶液依次穿過樣品墊、金標墊和硝酸纖維素膜的吸水紙。檢測時，待測樣品滴加在樣品孔中，在毛細作用下向前層析，當層析到t線時，有目標抗原存在則形成“抗體—抗原—金標抗體”復合物，從而出現(xiàn)一條紅色反應線即為陽性；無紅色反應線出現(xiàn)則為陰性。無論是否有目標抗原，c線都會出現(xiàn)一條紅色反應線，以判定層析過程是否正常，檢測是否有效。

3、水凝膠聚合物納米顆粒是由c-c鍵鏈接而成的高分子聚合物，由各種功能單體通過自由基引發(fā)聚合反應形成，主鏈為c-c長鏈，側鏈則為各種不同功能單體，常涉及的功能單體有丙烯酰胺以及甲基丙烯酸衍生物，如n-丙烯酰基-l-氨基酸、2-甲基丙烯?；?l-氨基酸-nh2。水凝膠共聚物能否實現(xiàn)特異分子識別功能，關鍵就在于其側鏈中引入的功能單體是否能提供與目標生物分子結合位點高度互補的疏水、氫鍵、靜電、π-π堆積作用等多重相互作用，這些相互作用與功能單體所帶的疏水性、親水性和(或)帶電性基團密切相關。由于各功能單體的種類和配比可調(diào)，使合成的水凝膠聚合物納米顆粒具有更為廣泛的化學多樣性，利用此特點，可構建出結構和功能靈活多樣的聚合物納米顆粒文庫。水凝膠聚合物納米顆粒制備過程簡單，成本低廉，一步合成法有助于其規(guī)模化和快速生產(chǎn)，穩(wěn)定性和魯棒性好，對ph、溫度等外界環(huán)境具有很強的耐受能力，已被用于各種復雜體系中靶標生物分子的提取、分離、純化和去除，更有望取代天然抗體在生物技術領域發(fā)揮特定的作用和功能。

4、人工合成聚合物納米顆粒側鏈中引入的功能單體，尤其是氨基酸單體，與蛋白抗體肽鏈中氨基酸側基的結構和性質(zhì)相似，其之所以能夠特異性識別目標生物分子，達到與生物抗體/受體類似的功效，也正是因為其能夠模擬天然生物大分子，如抗原-抗體之間特異性的多重互補相互作用(水合互補性，hydropathic?complementarity)，使其具有類似于抗體識別抗原的功能，因此又被稱作“聚合物仿生親和配體”或者“非生物抗體”。因此，本發(fā)明利用sars-cov-2編碼的結構蛋白如s蛋白，分析s蛋白與其宿主細胞受體結合的晶體結構信息以及分子識別機制，通過分子對接等手段，得到對s蛋白受體結合域(receptorbinding?domain,rbd)具有較高親和力的氨基酸功能單體，并調(diào)控候選功能單體的種類和配比，合成一系列具有不同結構和表面化學性質(zhì)的聚合物納米顆粒組成文庫，通過對s蛋白rbd的親和實驗，從文庫中篩選出結合能力更強的水凝膠聚合物納米顆粒。利用這種基于理性設計與定向化學進化相結合的方法，最終獲得對新冠病毒s蛋白具有高親和力和高選擇性的水凝膠聚合物仿生親和配體。在此基礎上，與膠體金原位聚合，得到具有核殼結構的膠體金標記的水凝膠聚合物納米顆粒，并基于抗原檢測技術，建立由人工合成的非生物抗體代替生物抗體的側向?qū)游隹梢暬瘷z測平臺，為sars-cov-2體外診斷與環(huán)境樣本檢測提供新的方法，為未來新發(fā)突發(fā)傳染病疫情的快速響應提供更多可能。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的第一個目的是提供一種膠體金標記的水凝膠聚合物納米顆粒，將其作為親和探針，并利用其能與新冠病毒(sars-cov-2)的刺突蛋白(spike，s)及其受體結合域(receptor?binding?domain,rbd)特異性結合形成穩(wěn)定復合物的特性，實現(xiàn)對sars-cov-2病毒抗原的非生物抗體快速識別與檢測。

2、本發(fā)明提供的親和探針，它是由非生物抗體外殼和示蹤標記物內(nèi)核形成的核殼結構，所述非生物抗體外殼是由n-丙烯酰基-l-色氨酸(atrp)、n-烷基丙烯酰胺、n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺進行自由基鏈式聚合反應形成的水凝膠共聚物(atrp-nps)，所述示蹤標記物內(nèi)核是金納米顆粒。

3、進一步地，所述n-丙烯?；?l-色氨酸、n-烷基丙烯酰胺、n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺三者的摩爾比為20-80：15-80：1-5。

4、一種制備所述膠體金標記的水凝膠聚合物納米顆粒(au@atrp-nps)的方法，包括以下步驟：首先對金納米顆粒進行3-丁烯胺鹽酸鹽修飾，然后加入n-丙烯?；?l-色氨酸、n-烷基丙烯酰胺、n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺，接著加入引發(fā)劑并在氮氣保護下在金納米顆粒表面進行自由基鏈式聚合反應，生成水凝膠共聚物原位并聚合在膠體金表面。

5、優(yōu)選地，所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈。

6、本發(fā)明進一步提供所述的膠體金標記的水凝膠聚合物納米顆粒在制備sars-cov-2病毒檢測試紙條中的應用以及一種sars-cov-2病毒檢測試紙條。

7、優(yōu)選地，該試紙條是檢測sars-cov-2病毒s蛋白的非生物抗體側向?qū)游鲈嚰垪l，試紙條中含有所述的膠體金標記的水凝膠聚合物納米顆粒。

8、進一步優(yōu)選地，該試紙條包括樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述硝酸纖維素膜上設有檢測線和質(zhì)控線，所述膠體金標記的水凝膠聚合物納米顆粒滴加在樣品墊上；所述質(zhì)控線上含有表面帶正電荷的水凝膠聚合物納米顆粒；所述檢測線上含有待測樣品溶液。

9、進一步優(yōu)選地，所述膠體金標記的水凝膠聚合物納米顆粒的使用濃度為0.01-0.2mg/ml，滴加體積為20-100μl。

10、進一步優(yōu)選地，所述表面帶正電荷的水凝膠聚合物納米顆粒是由2-甲基丙烯?；?賴氨酸-nh2(mlys)、n-烷基丙烯酰胺、n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺通過自由基鏈式聚合反應生成，所述n-烷基丙烯酰胺由n-異丙基丙烯酰胺、n-叔丁基丙烯酰胺組成，所述2-甲基丙烯?；?賴氨酸-nh2、n-異丙基丙烯酰胺、n-叔丁基丙烯酰胺、n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺四者的摩爾比為20-40：15-35：30-50：1-5。

11、本發(fā)明的另一目的是提供一種sars-cov-2病毒非診斷目的檢測方法，包括以下步驟：

12、s1、以金納米顆粒作為示蹤標記物內(nèi)核，在其表面進行3-丁烯胺鹽酸鹽修飾，然后向金納米顆粒中加入n-丙烯酰基-l-色氨酸、n-烷基丙烯酰胺、n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺以及引發(fā)劑，在氮氣保護下進行自由基鏈式聚合反應，將反應得到的膠體金標記的水凝膠聚合物納米顆粒作為親和探針并濃縮備用；

13、s2、向2-甲基丙烯?；?賴氨酸-nh2、n-烷基丙烯酰胺、n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺中加入引發(fā)劑，在氮氣保護下進行自由基鏈式聚合反應，合成表面帶正電荷的水凝膠聚合物納米顆粒；

14、s3、將樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水墊組裝在支撐底板上，將待測樣品溶液點在硝酸纖維素膜的檢測線上，將步驟s2制備的表面帶正電荷的水凝膠聚合物納米顆粒劃在硝酸纖維素膜的質(zhì)控線上，然后進行干燥；

15、s4、將步驟s1制備的親和探針滴加到樣品墊上進行側向?qū)游鰴z測，若檢測線和質(zhì)控線同時顯色，檢測結果為sars-cov-2陽性；若檢測線不顯色，質(zhì)控線顯色，檢測結果為sars-cov-2陰性。

16、本發(fā)明為了實現(xiàn)sars-cov-2病毒的非生物抗體檢測，分別制備了兩種水凝膠聚合物納米顆粒，一種是以n-丙烯?；?l-色氨酸為主要功能單體合成的水凝膠共聚物，并將其作為非生物抗體外殼包裹金納米顆粒，形成一種膠體金標記的水凝膠聚合物納米顆粒親和探針(au@atrp-nps)，它能夠特異性識別并結合sars-cov-2s蛋白的rbd結構域；另一種是以2-甲基丙烯?；?賴氨酸-nh2為主要功能單體合成的水凝膠聚合物納米顆粒(mlys-nps)，它基于靜電作用與上述親和探針結合，實現(xiàn)檢測平臺質(zhì)控線(c)的應用?；谏鲜鰞煞N非生物抗體，建立側向?qū)游鰴z測平臺，采用直接法，實現(xiàn)新冠病毒的快速檢測。

17、本發(fā)明構建的檢測方法既可用于sars-cov-2病毒的疾病診斷，也能用于以非疾病診斷為目的的sars-cov-2病毒實驗室篩查鑒定、環(huán)境檢測等。

18、本發(fā)明的有益效果是：

19、本發(fā)明以水凝膠聚合物納米顆粒作為非生物抗體特異性結合sars-cov-2s蛋白，該非生物抗體具有優(yōu)異的親和力，與生物抗體相比，它具有合成條件溫和、制備過程簡單、成本低廉、穩(wěn)定性好，且具有較高的生物相容性和可塑性。

20、本發(fā)明建立的非生物抗體側向?qū)游隹梢暬瘷z測平臺，以一種膠體金標記的水凝膠聚合物納米顆粒親和探針(au@atrp-nps)作為檢測標準，以一種水凝膠聚合物納米顆粒(mlys-nps)作為質(zhì)控標準，整個檢測平臺無任何生物抗體，制備成本低廉、易于保存、穩(wěn)定性好，用以替代原有的生物抗體，克服了生物抗體開發(fā)難度大、成本高、環(huán)境耐受性差、易失活、保存和反應條件嚴苛等限制；同時檢測平臺無需專門的判讀儀器，反應時間短，僅需15～20min即可完成檢測，結果直觀讀取，無需掌握復雜的專業(yè)知識，在定性和半定量檢測方面也具有一定的應用潛力。