本發(fā)明涉及α4結(jié)合抗體和其片段。序列表本技術含有已經(jīng)由efs-web提交并且通過引用整體并入本文的序列表。所述序列表創(chuàng)建于2019年4月12日，命名為anti_vlasequence?patentin_st25并且大小為208千字節(jié)。

背景技術：

0、發(fā)明背景

1、整合素是介導細胞-細胞和細胞-基質(zhì)相互作用的細胞表面受體大家族的成員。它們以α鏈與β鏈的不同組合的非共價αβ異二聚體形式存在并且共有廣泛的結(jié)構(gòu)同源性。整合素介導廣泛多種生理過程并且與廣泛多種病理學疾患有關。α4鏈主要局限于白細胞并且可與兩種β鏈即β1和β7締合。

2、vla-4(也稱為α4β1)和α4β7在發(fā)炎性疾病的病理生理學中起重要作用。vla-4是β1整合素細胞表面受體家族的成員。vla-4含有α4鏈和β1鏈并且參與細胞-細胞相互作用。其表達主要局限于淋巴細胞，包括t淋巴細胞，以及骨髓細胞，包括小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞。vla-4結(jié)合內(nèi)皮細胞配體vcam-1(血管細胞粘附分子-1)，并且可介導t淋巴細胞和b淋巴細胞附連到人類血漿纖維連接蛋白的肝素ii結(jié)合片段。vla-4調(diào)控正常白細胞運輸(lobb和hemler,j.clin.invest.94(5):1722-1728,1994)并且提供支持細胞活化的關鍵共刺激信號(clark和brugge,science?268(5208):233-9,1995)。在炎性反應期間，vla-4調(diào)控白細胞向受損組織中遷移，并且因而已被公認為有吸引力的治療靶標。使用阻斷性單克隆抗體(lobb和hemler,同上；enders等人,brain?121(pt?7):1257-66,1998；ramos-barbon等人,am?j?respir?crit?care?med.163(1):101-8.2001)、抑制性肽(molossi等人,j?clininvest.95(6):2601-10,1995；abraham,1997；van?der?laan等人,jneurosci?res.2002年1月15日；67(2):191-9,2002)和小分子拮抗劑(kudlacz等人,j.pharmacol.exp.ther.301(2):747-52,2002)進行的體內(nèi)研究已驗證α4β1整合素在白細胞介導的炎癥中的關鍵作用。

3、α4β1通過結(jié)合到兩種蛋白質(zhì)配體即vcam-1或纖維連接蛋白(例如，含有交替剪接的連接區(qū)段1(cs1)的纖維連接蛋白變體)中的任一者來介導細胞粘附(osborn等人,cell59(6):1203-11,1989；wayner等人,j.cell?biol.109(3):1321-30,1989)。已鑒定其他潛在配體(bayless等人,j.cell?sci.111(pt?9):1165-74,1998)；然而，這些相互作用的生物學意義尚不太清楚。α4β1與其配體之間的相互作用具有低親和力，并且有可能經(jīng)由多價相互作用來調(diào)節(jié)結(jié)合。盡管α4β1的表達是組成性的，但其與配體的相互作用在可由包括抗原、抗t細胞受體mab、伏波醇酯、二價陽離子mn2+和某些β1特異性抗體的各種刺激誘導的活化狀態(tài)下強烈增強。這些親和力和/或親合力的變化最終決定相互作用是否有效并且使配體/整合素復合物穩(wěn)定(humphries,curr?opin?cell?biol.8(5):632-40,1996)。α4β7由更局限的一組白細胞表達，并且在某種程度上負責通過結(jié)合粘膜地址素madcam而使淋巴細胞歸巢至粘膜淋巴組織，但其也結(jié)合vcam-1和纖維連接蛋白。某些針對α4的單克隆抗體(mab)可阻斷vla4和α4β7二者的粘附功能。

4、可使用人源化抗體代替鼠類抗體作為治療劑來避免在人類中出現(xiàn)稱為hama(人類抗小鼠抗體)反應的不理想免疫反應。一般通過將人類抗體的互補決定區(qū)(cdr)置換為另一物種(通常是小鼠抗體)的cdr來構(gòu)建人源化抗體。

5、抗體能夠經(jīng)由其可變區(qū)結(jié)合抗原?？贵w一旦結(jié)合抗原后，就靶向抗原以進行破壞，該過程通常至少部分由所述抗體的恒定區(qū)或fc區(qū)介導。存在若干種由抗體fc區(qū)介導的效應功能或活性。一種效應功能是能夠結(jié)合可在稱為補體依賴性細胞毒性(cdc)的過程中輔助溶解靶抗原，例如細胞病原體的補體蛋白。fc區(qū)的另一個效應活性是結(jié)合到免疫細胞或能夠觸發(fā)其他免疫效應的所謂效應細胞表面上的fc受體(例如fcγr)。這些免疫效應(例如，抗體依賴性細胞毒性(adcc)和抗體依賴性細胞吞噬作用(adcp))通過例如釋放免疫活化因子和調(diào)控抗體產(chǎn)生、內(nèi)吞作用、吞噬作用和細胞殺傷而在移除病原體/抗原方面起作用。在一些臨床應用中，這些反應對抗體的功效至關重要，而在其他情況下，其會激起不需要的副作用。效應因子介導的副作用的一個實例是釋放引起急性發(fā)熱反應的炎性細胞因子。另一個實例是攜帶抗原的細胞的長期耗竭。

6、可通過使用缺乏fc區(qū)的抗體片段(例如，如fab、f(ab')2或單鏈fv(scfv))來避免抗體的效應功能。然而，這些片段由于通過腎臟快速清除而具有降低的半衰期。fab和scfv片段僅具有一個抗原結(jié)合位點而不是兩個，從而可能犧牲由于結(jié)合親合力而具有的任何優(yōu)勢并在制造方面帶來潛在挑戰(zhàn)。替代方法旨在降低全長抗體的效應功能，而保留fc區(qū)的其他有價值屬性(例如，延長的半衰期和異二聚化)。一種降低效應功能的方法是通過消除與fc區(qū)中特定殘基連接的糖來產(chǎn)生所謂的無糖基化抗體。無糖基化抗體可通過例如缺失或改變糖附連的殘基、在酶作用下移除糖、在糖基化抑制劑存在下培養(yǎng)的細胞中產(chǎn)生抗體或通過在不能使蛋白質(zhì)糖基化的細胞(例如，細菌宿主細胞)中表達抗體來產(chǎn)生。另一種方法是采用來自igg4抗體而非igg1的fc區(qū)。眾所周知，igg4抗體的特征在于補體活化和抗體依賴性細胞毒性的水平低于igg1。

7、針對人類α4的單克隆抗體結(jié)合到三種功能不同的形貌表位a、b和c(pulido等人,j.biol.chem.266:10241-10245,1991；schiffer等人,j.biol.chem.270:14270-14273,1995)。表位b再分為b1表位和b2表位，它們在形貌上不可區(qū)分但可由mab誘導細胞聚集的能力來定義。針對表位a和b2的抗α4mab可誘導同型細胞聚集，但針對表位b1和c的那些抗α4mab則不然。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明涉及包含種系可變區(qū)框架的抗vla-4抗體和其結(jié)合片段，其可使cdr移植α4結(jié)合抗體，如抗vla-4抗體優(yōu)化。因此，本發(fā)明包含抗vla-4可變重(vh)鏈和可變輕(vl)鏈以及包括這些框架的抗體分子。在一些實施方案中，所述vla-4是人類vla-4。在一些實施方案中，所述vla-4包含α4鏈(例如，人類α4鏈)。

2、所述抗體還可含有被修飾的fc區(qū)，所述被修飾的fc區(qū)改變或降低效應功能并且改進穩(wěn)定性。具有被修飾的fc區(qū)的抗體可改進在缺乏低聚糖的抗體中所觀測的顯著不利影響，特別是對構(gòu)象和穩(wěn)定性的不利影響。具有被修飾的fc區(qū)的抗體也可具有改變或降低的效應功能和改進的穩(wěn)定性。本發(fā)明還涉及制造本文中所描述的分子的方法。

3、所述抗體可通過提供用于增強fc區(qū)穩(wěn)定性的改進方法來改善現(xiàn)有技術“無效應因子”抗體的問題。舉例來說，本發(fā)明提供穩(wěn)定性工程化的fc多肽，例如穩(wěn)定化igg抗體或其他含fc的結(jié)合分子，其包含多肽fc區(qū)中的穩(wěn)定化氨基酸。在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于在親本fc多肽的fc區(qū)中的特定氨基酸殘基位置引入使fc區(qū)穩(wěn)定性增強的突變的方法。在一些實施方案中，穩(wěn)定化fc多肽具有改變或降低的效應功能(相較于不包含穩(wěn)定化氨基酸的多肽)并且展現(xiàn)增強的穩(wěn)定性(相較于親本fc多肽)。在一些實施方案中，所述親本fc多肽是人類igg1(例如，具有seq?id?no:83的序列)。在一些實施方案中，所述親本fc多肽是人類igg4(例如，具有seq?id?no:84的序列)。

4、因此，本文中所公開的抗體可提供若干優(yōu)勢，包括但不限于以下：

5、-提供由于其降低的效應功能而適合作為治療劑的包含穩(wěn)定化無糖基化fc區(qū)的穩(wěn)定化無糖基化fc多肽，例如穩(wěn)定化融合蛋白或無糖基化igg抗體；

6、-提供由于其降低的效應功能而適合作為治療劑的包含來源于igg4抗體的fc區(qū)的穩(wěn)定化fc多肽，例如穩(wěn)定化糖基化或無糖基化融合蛋白或igg4抗體；

7、-在對多肽進行最小變化的情況下產(chǎn)生穩(wěn)定化fc多肽的有效方法(例如，通過向非穩(wěn)定化親本多肽中引入變化或通過表達編碼穩(wěn)定化fc多肽的核酸分子)；

8、-增強fc多肽的穩(wěn)定性同時避免免疫原性和/或效應功能的任何增加的方法；

9、-用于增強fc多肽的可調(diào)性、制造和/或長期穩(wěn)定性的方法；和

10、-用本發(fā)明的穩(wěn)定化fc多肽治療需要治療的受試者的方法。

11、在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種抗α4抗體vh鏈，其具有來自供體抗α4抗體，例如本文中所描述的抗α4抗體的cdr以及具有來自vh鏈種系可變區(qū)序列的序列的區(qū)域1、2、3和4或相對于vh鏈種系可變區(qū)序列具有不超過5、10或15個差異的vh框架。在一個實施方案中，可變框架區(qū)4(fr4)是人類共有序列。在一個實施方案中，存在完整vh鏈框架區(qū)fr1、fr2、fr3和fr4。在另一個實施方案中，所述鏈是vh區(qū)的抗原結(jié)合片段。

12、在一個實施方案中，所述種系序列是圖1中所描繪的人類ighv1-f(seq?id?no:2)。在某些實施方案中，所述vh框架序列相對于種系序列例如seq?id?no:2可能有至少一個但不超過2、3、4、5、10或15個氨基酸殘基不同。在一個實施方案中，所述vh框架還包括除相應人類殘基以外的殘基。舉例來說，所述vh鏈在seq?id?no:2的框架位置24、67、76、80和94(kabat編號)中的一者或多者處包括非典型殘基。

13、在一個實施方案中，可變域的互補決定區(qū)(cdr)中的至少一者或多者來源于供體非人類α4結(jié)合抗體(即，特異性結(jié)合到α4的非人類抗體)。在一個實施方案中，cdr移植重鏈可變域的抗原結(jié)合區(qū)包括對應于位置26-34(cdr1)、50-65(cdr2)和95-102(cdr3)(kabat編號)的cdr。

14、因而，在一個實施方案中，所述可變重鏈(vh)框架具有來源于人類抗體種系序列ighv1-f的受體序列。

15、在另一個實施方案中，vh的fr1區(qū)中的至少一個氨基酸并且少于2、3、4、5或10個氨基酸殘基不是相應人類種系殘基。舉例來說，所述殘基中的一者或多者可與cdr序列所來源的非人類抗體框架區(qū)同一。在一個實施方案中，使kabat位置24處的氨基酸殘基突變以便與非人類抗體框架區(qū)同一。

16、在另一個實施方案中，vh的fr2區(qū)中的至少一個氨基酸并且少于2、3、4、5或10個氨基酸殘基不是相應人類種系殘基。舉例來說，所述殘基中的一者或多者可與cdr序列所來源的非人類抗體框架區(qū)同一。

17、在另一個實施方案中，vh鏈的fr3中的至少一個氨基酸并且少于2、3、4、5或10個氨基酸殘基不是相應人類種系殘基。舉例來說，所述殘基中的一者或多者可與cdr序列所來源的非人類抗體框架區(qū)同一。在一個實施方案中，kabat位置94處的氨基酸殘基與非人類抗體框架區(qū)同一。在另一個實施方案中，kabat位置67、76、80和94處的氨基酸殘基與非人類抗體框架區(qū)同一。

18、在某些實施方案中，所述抗體的vh鏈具有seq?id?no:3、seq?id?no:4或seq?idno:5的序列。

19、在一個方面，本發(fā)明提供一種抗vla-4vl鏈，其具有來自供體抗vla-4抗體，例如本文中所描述的抗vla-4抗體的cdr以及具有來自vl鏈種系可變區(qū)序列的序列的區(qū)域1、2、3和4或相對于vl鏈種系可變區(qū)序列具有不超過5、10或15個差異(每個區(qū)域或總共)的vl框架。在一個實施方案中，可變框架區(qū)4(fr4)是人類共有序列。在一個實施方案中，存在完整vl鏈框架區(qū)fr1、fr2、fr3和fr4。在另一個實施方案中，所述鏈是vl區(qū)的抗原結(jié)合片段。

20、在另一個實施方案中，所述種系序列是圖2中所描繪的igkv4-1(seq?id?no:7)。在其他實施方案中，所述vl框架序列相對于種系框架序列，例如seq?id?no:7可能有至少一個但不超過2、3、4、5、10或15個氨基酸殘基不同。在另一個實施方案中，所述vl還包括除相應人類氨基酸殘基以外的殘基。舉例來說，所述vl鏈進一步在seq?id?no:7的框架位置1、73和87(kabat編號)中的一者或多者處包括非人類殘基。

21、在一個實施方案中，所述序列是圖2中所描繪的aah7035.1(seq?id?no:12)或其種系工程化型式(seq?id?no:13)。在一些實施方案中，所述vl框架序列相對于種系工程化框架序列例如seq?id?no:13可能有至少一個但不超過5、10、15、20或25個氨基酸殘基不同。在一個實施方案中，所述vl鏈包括除相應人類殘基以外的殘基。舉例來說，所述vl鏈在seq?idno:12的框架位置1和87(kabat編號)中的一者或多者處包括非人類殘基。在另一個實施方案中，所述vl在框架區(qū)中包括氨基酸取代以類似于不同的人類種系框架序列，例如種系序列igkv4-1。在某些實施方案中，在seq?id?no:12的位置1-3、5-23、35-37、39-42、45-49、57、59-61、63-64、70-72、74-84、86-88、99-106(kabat編號)處對所述vl框架序列進行改變以便與igkv4-1種系序列同一。

22、在一個實施方案中，可變域的互補決定區(qū)(cdr)中的至少一者或多者來源于供體非人類α4結(jié)合抗體。在另一個實施方案中，cdr移植重鏈可變域的抗原結(jié)合區(qū)包括對應于位置24-31(cdr1)、50-56(cdr2)和89-97(cdr3)(kabat編號)的cdr。因而，在一個實施方案中，所述vl框架具有由igkv4-1種系序列、由抗體aah70335.1或由種系工程化抗體aah70335.1構(gòu)建的受體序列。

23、在另一個實施方案中，vl鏈的fr1中的至少一個氨基酸并且少于2、3、4、5、10或15個殘基不是相應人類殘基。舉例來說，所述殘基中的一者或多者可與cdr序列所來源的非人類抗體框架區(qū)同一。在一個實施方案中，使fr1的n端位置處的氨基酸殘基突變以便與非人類抗體框架區(qū)同一。

24、在另一個實施方案中，vl鏈的fr2中的至少一個氨基酸并且少于2、3、4、5、10或15個殘基不是相應人類殘基。舉例來說，所述殘基中的一者或多者可與cdr序列所來源的非人類抗體框架區(qū)同一。

25、在另一個實施方案中，vl鏈的fr3中的至少一個氨基酸并且少于2、3、4、5、10或15個殘基不是相應人類殘基。舉例來說，所述殘基中的一者或多者可與cdr序列所來源的非人類抗體框架區(qū)同一。在另一個實施方案中，使kabat位置87處的氨基酸殘基突變以便與非人類抗體框架區(qū)同一。在另一個實施方案中，使kabat位置67和87處的氨基酸殘基突變以便與非人類抗體框架序列同一。在另一個實施方案中，使seq?id?no:7的kabat位置67、73和87處的氨基酸殘基突變以便與非人類抗體框架序列同一。

26、在其他實施方案中，所述抗體的vl鏈具有seq?id?no:8、seq?id?no:9、seq?id?no:10或seq?id?no:11的序列。

27、在一個實施方案中，所述抗體的vh鏈具有seq?id?no:4的序列并且所述抗體的vl鏈具有seq?id?no:11的序列。

28、在一個實施方案中，對vh和vl受體框架序列的cdr進行選擇以類似于非人類(例如鼠類)抗體序列的cdr序列，其中所述非人類抗體結(jié)合整合素α4或其片段。在另一個實施方案中，對cdr的序列進行選擇以類似于結(jié)合vla-4α4鏈的b1表位的非人類抗體的cdr的序列。在一個實施方案中，對cdr進行選擇以類似于鼠類單克隆抗體，例如hp1/2、hp2/1、hp2/4、l25、p4c2或21.6(pulido等人,j.biol.chem.266:10241-10245,1991；美國專利第6,033,665號)。修飾可意指例如切割和插入或變化，例如通過定向突變誘發(fā)。

29、在另一方面，本發(fā)明提供一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其包括：

30、-本文中所描述的抗vla-4vl鏈，例如具有來自供體抗vla-4抗體，例如本文中所描述的抗vla-4抗體的cdr以及具有來自vl鏈種系可變區(qū)序列的序列的lc框架區(qū)1、2和3或相對于vl鏈種系可變區(qū)序列具有不超過5、10或15個差異的vl框架的抗vla-4vl鏈。在一個實施方案中，可變區(qū)4是人類共有序列；以及

31、-本文中所描述的抗vla-4vh鏈，例如具有來自供體抗vla-4抗體，例如本文中所描述的抗vla-4抗體的cdr以及具有來自vl鏈種系可變區(qū)序列的序列的lc框架區(qū)1、2和3或相對于vl鏈種系可變區(qū)序列具有不超過5、10或15個差異的vl框架的抗vla-4vl鏈。在一個實施方案中，可變區(qū)4是人類共有序列。

32、在一個實施方案中，所述抗體結(jié)合α4β1和α4β7中的一者或兩者。

33、在另一方面，本文中所描述的vl或vh鏈或抗體或其片段被可檢測地標記。

34、在另一方面，本發(fā)明提供一種重組抗α4抗體或其α4結(jié)合片段，其包含：(a)含有seqid?no:11的序列的可變輕鏈；(b)含有seq?id?no:4的序列的可變重鏈；(c)人類κ輕鏈(seqid?no:82)的恒定輕鏈；和(d)人類igg1的恒定重鏈，所述恒定區(qū)包含至少一個選自以下的突變：根據(jù)kabat編號方案的s127c、k129r、g135e、g136s、q203k、i207t、n211d、k222r、p227s、s232y、c233g、d234缺失、k235缺失、t236缺失、h237p、t238p、l247f、h281q、k287q、y313f、n314q、a346g、a349s、p350s或k478缺失。

35、在一些實施方案中，人類igg1的恒定重鏈包含至少兩個突變，由至少兩個突變組成或基本上由至少兩個突變組成，所述突變選自：根據(jù)kabat編號方案的s127c、k129r、g135e、g136s、q203k、i207t、n211d、k222r、p227s、s232y、c233g、d234缺失、k235缺失、t236缺失、h237p、t238p、l247f、h281q、k287q、y313f、n314q、a346g、a349s、p350s或k478缺失。

36、在一些實施方案中，人類igg1的恒定重鏈包含至少三個突變，由至少三個突變組成或基本上由至少三個突變組成，所述突變選自：根據(jù)kabat編號方案的s127c、k129r、g135e、g136s、q203k、i207t、n211d、k222r、p227s、s232y、c233g、d234缺失、k235缺失、t236缺失、h237p、t238p、l247f、h281q、k287q、y313f、n314q、a346g、a349s、p350s或k478缺失。

37、在一些實施方案中，人類igg1的恒定重鏈包含以下，由以下組成或基本上由以下組成：至少四個、或至少五個、或至少六個、或至少七個、或至少八個、或至少九個、或至少十個、或至少十一個、或至少十二個、或至少十三個、或至少十四個、或至少十五個、或至少十六個、或至少十七個、或至少十八個、或至少十九個、或至少二十個、或至少二十一個、或至少二十二個、或至少二十三個、或至少二十四個突變，所述突變選自以下：根據(jù)kabat編號方案的s127c、k129r、g135e、g136s、q203k、i207t、n211d、k222r、p227s、s232y、c233g、d234缺失、k235缺失、t236缺失、h237p、t238p、l247f、h281q、k287q、y313f、n314q、a346g、a349s、p350s或k478缺失。

38、在一些實施方案中，人類igg1的恒定重鏈包含以下突變，由以下突變組成，或基本上由以下突變組成：根據(jù)kabat編號方案的s127c、k129r、g135e、g136s、q203k、i207t、n211d、k222r、p227s、s232y、c233g、d234缺失、k235缺失、t236缺失、h237p、t238p、l247f、h281q、k287q、y313f、n314q、a346g、a349s、p350s和k478缺失。

39、在另一方面，本發(fā)明提供一種重組抗α4抗體或其α4結(jié)合片段，其包含：(a)含有seqid?no:11的序列的可變輕鏈；(b)含有seq?id?no:4的序列的可變重鏈；(c)人類κ輕鏈(seqid?no:82)的恒定輕鏈；和(d)人類igg4的恒定重鏈，所述恒定區(qū)包含至少一個選自由以下組成的組的突變：根據(jù)kabat編號方案的s241p、n314q、q376r、e377d、m381l、r440k、e450q、l476p和k478缺失。

40、在一些實施方案中，人類igg4的恒定重鏈包含至少兩個突變，由至少兩個突變組成或基本上由至少兩個突變組成，所述突變選自由以下組成的組：根據(jù)kabat編號方案的s241p、n314q、q376r、e377d、m381l、r440k、e450q、l476p和k478缺失。

41、在一些實施方案中，人類igg4的恒定重鏈包含以下，由以下組成或基本上由以下組成：至少三個、或至少四個、或至少五個、或至少六個、或至少七個、或至少八個、或至少九個突變，所述突變選自由以下組成的組：根據(jù)kabat編號方案的s241p、n314q、q376r、e377d、m381l、r440k、e450q、l476p和k478缺失。

42、在一些實施方案中，人類igg4的恒定重鏈包含以下，由以下組成或基本上由以下組成：下列突變中的一者或多者：根據(jù)kabat編號方案的s241p、n314q、q376r、e377d、m381l、r440k、e450q、l476p和k478缺失。

43、注意，c端賴氨酸殘基(在根據(jù)kabat編號方案的478位)通常在翻譯后或通過手段缺失。因而，在一些實施方案中，本文中所描述的抗體的重鏈(或其結(jié)構(gòu)域的fc部分)缺乏c端賴氨酸。換句話說，在一些實施方案中，本文中所描述的抗體的重鏈(或其結(jié)構(gòu)域的fc部分)中478位(kabat編號)的賴氨酸缺失。

44、在一些實施方案中，無突變或取代的人類igg1的恒定重鏈具有seq?id?no:83的序列。

45、在一些實施方案中，無突變或取代的人類igg4的恒定重鏈具有seq?id?no:84的序列。

46、在另一方面，本發(fā)明提供一種載體，其含有編碼本文中所描述的抗體重鏈或其α4結(jié)合片段的dna。在一些實施方案中，所述載體的dna編碼具有seq?id?no:3、seq?id?no:4或seq?id?no:5的序列的vh。

47、在另一方面，本發(fā)明提供一種載體，其含有編碼本文中所描述的抗體輕鏈或其α4結(jié)合片段的dna。在一些實施方案中，所述載體的dna編碼具有seq?id?no:8、seq?id?no:9、seq?id?no:10或seq?id?no:11的序列的vl鏈。

48、在另一方面，本發(fā)明提供一種載體，其含有編碼本文中所描述的抗體重鏈或其α4結(jié)合片段和本文中所描述的抗體輕鏈或其α4結(jié)合片段的dna。

49、在另一方面，本發(fā)明提供一種宿主細胞，其含有本文中所描述的載體，例如能夠表達本文中所描述的重鏈和/或輕鏈抗體或抗體片段的載體。在某些實施方案中，所述宿主細胞是中國倉鼠卵巢(cho)細胞。

50、在一個方面，本發(fā)明提供一種制造重組抗α4抗體或其α4結(jié)合片段的方法，所述方法是通過以下實現(xiàn)：提供用(a)編碼本文中所描述的抗體重鏈或其α4結(jié)合片段的dna序列和(b)編碼抗體輕鏈或其α4結(jié)合片段的dna序列轉(zhuǎn)染的宿主細胞，以及培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞以產(chǎn)生所述重組抗α4抗體分子或其α4結(jié)合片段。編碼抗體重鏈和輕鏈的dna可處于同一載體上或處于不同載體上。

51、在一個方面，本發(fā)明提供一種制造重組抗α4抗體或其α4結(jié)合片段的方法，所述方法是通過以下實現(xiàn)：提供用(a)編碼抗體重鏈或其α4結(jié)合片段的dna序列(其中所述dna序列具有seq?id?no:4的序列)和(b)編碼抗體輕鏈或其α4結(jié)合片段的dna序列(其中所述dna序列具有seq?id?no:11的序列)轉(zhuǎn)染的宿主細胞，以及培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞系以產(chǎn)生所述重組抗α4抗體分子或其α4結(jié)合片段。編碼抗體重鏈和輕鏈的dna可處于同一載體上或處于不同載體上。

52、在另一方面，本發(fā)明提供一種治療由α4整合素例如α4β1(vla-4)或α4β7整合素介導的疾病或病癥的方法，所述方法是通過向需要這種治療的受試者施用本文中所描述的α4抗體或抗體片段或者含有所述抗體或片段的藥物組合物來實現(xiàn)。所述受試者可能患有或處在患上例如以下疾病的風險下：發(fā)炎性、免疫性或自身免疫性病癥(例如，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，例如多發(fā)性硬化癥、腦膜炎、視神經(jīng)脊髓炎、神經(jīng)結(jié)節(jié)病、cns血管炎、腦炎和橫貫性脊髓炎)、組織或器官移植物排斥反應或移植物抗宿主病；急性cns損傷，例如中風、創(chuàng)傷性腦損傷(tbi)或脊髓損傷(sci)；慢性腎?。贿^敏，例如過敏性哮喘；1型糖尿??；發(fā)炎性腸病，例如克羅恩病(crohn's?disease)、潰瘍性結(jié)腸炎；重癥肌無力；纖維肌痛；關節(jié)炎性病癥，例如類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬性關節(jié)炎；發(fā)炎性/免疫性皮膚病癥，例如牛皮癬、白癜風、皮炎、扁平苔蘚；全身性紅斑狼瘡；修格連氏綜合征(sjogren'ssyndrome)；血液學癌癥，例如多發(fā)性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤；實體癌，例如肉瘤或癌瘤，例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、腦癌；和纖維化病癥，例如肺纖維化、骨髓纖維化、肝硬化、腎小球膜增生性腎小球腎炎、新月體性腎小球腎炎、糖尿病性腎病和腎間質(zhì)性纖維化。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種治療患有多發(fā)性硬化癥的患者或減輕患有多發(fā)性硬化癥的患者的癥狀的方法，所述多發(fā)性硬化癥是例如臨床孤立綜合征、復發(fā)性緩解性多發(fā)性硬化癥或活動性繼發(fā)性進行性多發(fā)性硬化癥。在某些實施方案中，所述多發(fā)性硬化癥是多發(fā)性硬化癥的復發(fā)形式。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種治療患有癲癇癥(包括耐藥性癲癇癥)或處于患上癲癇癥(包括耐藥性癲癇癥)的風險下的患者的方法。在某些實施方案中，所述受試者或患者是人類。

53、在另一方面，本發(fā)明提供一種通過向患者施用α4結(jié)合抗體或抗體片段來治療患者的方法。在一個實施方案中，所述患者患有癌癥，例如實體腫瘤或血液學惡性病。舉例來說，用α4結(jié)合抗體或抗體片段治療的患者可能患有急性骨髓性白血病(aml)或多發(fā)性骨髓瘤(mm)。

54、在另一個實施方案中，所述患者患有發(fā)炎性病癥，例如多發(fā)性硬化癥、哮喘(例如中度至重度哮喘)、類風濕性關節(jié)炎、糖尿病或克羅恩病。在另一個實施方案中，所述組合物依據(jù)方案施用。在另一個實施方案中，所述方法還包括選擇適合用所述組合物治療的患者。舉例來說，適合治療的患者已顯示指示疾病發(fā)作的征象或癥狀，例如指示ms的征象或癥狀。在一個優(yōu)選實施方案中，所述患者患有癲癇癥。

55、在某些實施方案中，向所述患者施用治療有效量的α4結(jié)合抗體或抗體片段。在某些實施方案中，向所述患者施用約0.0003mg/kg、0.0004mg/kg、0.0005mg/kg、0.0006mg/kg、0.0007mg/kg、0.0008mg/kg、0.0009mg/kg、0.0010mg/kg、0.0015mg/kg或0.0020mg/kg至約0.0025mg/kg、0.003mg/kg、0.005mg/kg、0.010mg/kg、0.0125mg/kg、0.025mg/kg、0.050mg/kg、0.0625mg/kg、0.080mg/kg、0.100mg/kg、0.200mg/kg、0.300mg/kg、0.3125mg/kg、0.40mg/kg、0.50mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg范圍內(nèi)的量的α4結(jié)合抗體或抗體片段。在一些實施方案中，向所述患者施用約0.025mg/kg至約10mg/kg的量的α4結(jié)合抗體或抗體片段。在一些實施方案中，向所述患者施用約0.0625mg/kg至約8.0mg/kg的量的α4結(jié)合抗體或抗體片段。在一些實施方案中，向所述患者施用約0.3mg/kg至約6.0mg/kg的量的α4結(jié)合抗體或抗體片段。在一些實施方案中，向所述患者施用約0.5mg/kg至約5.0mg/kg的量的α4結(jié)合抗體或抗體片段。

56、在另一個實施方案中，所述方法還包括向所述患者施用第二治療劑，例如化學治療劑、血栓溶解劑、神經(jīng)保護劑、抗炎劑、類固醇、細胞因子或生長因子。

57、在一個實施方案中，向所述患者施用本文中所描述的人源化抗vla-4抗體或其片段，例如huhp1/2、h1l1、h1l2或h1l3。

58、在一個實施方案中，含有α4結(jié)合抗體的組合物依據(jù)方案，例如以有規(guī)律的時間間隔施用。舉例來說，所述組合物可每日一次、每周一次或每月一次；每周一次、每周兩次、每周三次、每周四次或更多次；或者每兩周一次、每三周一次、每四周一次或更長時間間隔施用。

59、在一個實施方案中，可根據(jù)患者的先前施用抗α4抗體的清除率來調(diào)節(jié)劑量。舉例來說，在一個實施方案中，在患者系統(tǒng)中的抗α4抗體水平降至預定水平以下之前，將不向患者施用第二或后續(xù)劑量。在一個實施方案中，測定來自患者的樣品(例如，血漿、血清、血液或尿液樣品)中抗α4抗體的存在，并且如果抗α4抗體水平高于預定水平，則將不向所述患者施用第二或后續(xù)劑量。如果患者系統(tǒng)中的抗α4抗體水平低于預定水平，則向所述患者施用第二或后續(xù)劑量。

60、在一個實施方案中，連續(xù)施用所述組合物，例如，在超過30分鐘但少于1、2、4或12小時的時段內(nèi)。含有抗體和第二劑的組合物可通過任何適當?shù)姆椒ɡ缃?jīng)皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)施用。

61、在一些實施方案中，所述抗體和所述第二劑各自以與各自用于單一療法時的處方劑量相同的劑量施用。在其他實施方案中，以等于或小于單獨施用時實現(xiàn)功效所需的量的劑量施用所述抗體。同樣，可以等于或小于單獨施用時實現(xiàn)功效所需的量的劑量施用所述第二劑。

62、本公開中所提供的另一方面是一種評估患者的方法，所述方法是通過以下實現(xiàn)：確定所述患者是否滿足預選標準，以及如果所述患者滿足所述預選標準，則對所述患者批準、提供、開具或施用本文中所描述的vla-4結(jié)合抗體制劑。在一個實施方案中，所述預選標準是患者未能充分響應于例如用于治療ms的先前替代治療性治療或方案。在另一個實施方案中，所述預選標準是不存在進行性多灶性白質(zhì)腦病(pml)的任何征象或癥狀，或者不存在pml的任何診斷。在一些情況下，選擇是基于不存在pml的風險因素，例如，受試者未檢驗為jc病毒dna陽性或未檢驗為jc病毒抗體陽性。在另一個實施方案中，所述標準如pct/us07/75577(公布為wo2008/021954)中所描述，所述文獻通過引用并入本文，其描述用于藥物分布和用于向患者提供藥物的方法和系統(tǒng)。

63、在另一方面，提供一種分布本文中所描述的組合物的方法。所述組合物含有α4結(jié)合抗體。所述方法包括向接受者(例如，最終使用者、患者、醫(yī)師、零售或批發(fā)藥房、經(jīng)銷商或醫(yī)院藥房部門、療養(yǎng)院診所或hmo)提供含有足夠單位劑量的藥物的包裝以治療患者至少6、12、24、36或48個月。在另一方面，本發(fā)明提供一種評估本文中所描述的含有α4結(jié)合抗體的組合物的包裝或包裝批次的質(zhì)量(例如，以確定其是否已到期)的方法。所述方法包括評估包裝是否已到期。到期日是距預選事件(例如制造、測定或包裝)至少6、12、24、36或48個月，例如超過24或36個月。在一些實施方案中，作為分析的結(jié)果，做出決定或步驟。舉例來說，取決于正確分析，對包裝中的抗體加以使用或丟棄、分類、選擇、發(fā)布或保留、運輸、移至新位置、準入市面、銷售或要約銷售、退出市面或不再要約銷售，視產(chǎn)品是否已到期而定。

64、在另一方面，本發(fā)明提供一種包裝，其含有至少兩個單位劑量的含有α4結(jié)合抗體的水性組合物。在一個實施方案中，所有單位劑量均含有相同量的抗體，并且在其他實施方案中，存在具有兩種或更多種強度或者兩種或更多種不同制劑，例如具有不同的強度或釋放性質(zhì)的單位劑量。

65、在另一方面，本發(fā)明包括指導接受者施用含有α4結(jié)合抗體的制劑的方法。所述方法包括指導接受者(例如，最終使用者、患者、醫(yī)師、零售或批發(fā)藥房、經(jīng)銷商或醫(yī)院藥房部門、療養(yǎng)院診所或hmo)應根據(jù)本文中所描述的方案將抗體施用于患者。所述方法還可包括指導接受者應在到期日之前施用抗體。到期日是距預選事件(例如制造、測定或包裝)至少6、12、24、36或48個月，例如超過24或36個月。在一個實施方案中，所述接受者也接受抗體供應，例如抗體單位劑量供應。

66、在一個實施方案中，穩(wěn)定多肽包含嵌合fc區(qū)，其中所述穩(wěn)定化多肽包含至少一個來源于人類igg4抗體的恒定域和至少一個來源于人類igg1抗體的恒定域。

67、在一個實施方案中，所述fc區(qū)是糖基化fc區(qū)。

68、在一個實施方案中，所述fc區(qū)是無糖基化fc區(qū)。

69、在一個實施方案中，所述fc區(qū)是在fc區(qū)第297位(eu編號)、第314位(kabat編號)包含谷氨酰胺(q)的無糖基化fc區(qū)。

70、在一個實施方案中，所述嵌合fc區(qū)包含來自igg4同種型的igg抗體的ch2結(jié)構(gòu)域和來自igg1同種型的igg抗體的ch3結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，包含來自igg4同種型的igg抗體的ch2結(jié)構(gòu)域和來自igg1同種型的igg抗體的ch3結(jié)構(gòu)域的嵌合fc區(qū)進一步在fc區(qū)第297位(eu編號)、第314位(kabat編號)包含谷氨酰胺(q)殘基而非天然存在的精氨酸(n)殘基。

71、在一個實施方案中，所述嵌合fc區(qū)包含來自igg4同種型的igg抗體的鉸鏈、ch1和ch2結(jié)構(gòu)域以及來自igg1同種型的igg抗體的ch3結(jié)構(gòu)域，并且其中所述抗體在氨基酸第228位(eu編號)、第241位(kabat編號)處包含脯氨酸。在一些實施方案中，所述嵌合fc區(qū)包含來自igg4同種型的igg抗體的鉸鏈、ch1和ch2結(jié)構(gòu)域以及來自igg1同種型的igg抗體的ch3結(jié)構(gòu)域，并且其中所述抗體在氨基酸第228位(eu編號)、第241位(kabat編號)處包含脯氨酸，進一步在fc區(qū)第297位(eu編號)、第314位(kabat編號)處包含谷氨酰胺(q)殘基而非天然存在的精氨酸(n)殘基。

72、在一個實施方案中，所述igg抗體是人類抗體。

73、在一個實施方案中，所述無糖基化fc區(qū)包含嵌合鉸鏈結(jié)構(gòu)域。

74、在一個實施方案中，所述嵌合鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含在氨基酸第228位(eu編號)、第241位(kabat編號)被脯氨酸殘基取代。

75、在一個實施方案中，所述抗體包含具有seq?id?no:4的序列的vh鏈，具有seq?idno:11的序列的vl鏈，包含來自igg4同種型的igg抗體的鉸鏈、ch1和ch2結(jié)構(gòu)域以及來自igg1同種型的igg抗體的ch3結(jié)構(gòu)域的嵌合fc區(qū)，并且其中所述抗體包含對ch2區(qū)中第297位(eu編號)、第314位(kabat編號)的谷氨酰胺殘基(q)的取代；對鉸鏈區(qū)中氨基酸第228位(eu編號)、第241位(kabat編號)的脯氨酸殘基(p)的取代；以及ch3區(qū)中第447位(eu編號)(第478位，kabat編號)的賴氨酸(k)的缺失。

76、在一個實施方案中，所述抗體包含具有seq?id?no:80的序列的重鏈和具有seq?idno:81的序列的輕鏈。

77、在一個實施方案中，所述抗體包含seq?id?no:86的重鏈，即igg4?hp1/2h1重鏈(野生型；糖基化)。

78、在一個實施方案中，所述抗體包含seq?id?no:87的重鏈，即igg4?hp1/2重鏈s228p(eu編號)(也稱為igg4p；糖基化)。

79、在一個實施方案中，所述抗體包含seq?id?no:88的重鏈，即igg4?hp1/2h1重鏈s228p?l235e(eu編號)(也稱為igg4pe；糖基化)。

80、在一個實施方案中，所述抗體包含seq?id?no:89的重鏈，即igg4?hp1/2h1重鏈s228p?t299a?(eu編號)(無糖基)。

81、在一個實施方案中，所述抗體包含seq?id?no:90的重鏈，即igg1?hp1/2h1重鏈n297q(eu編號)(無糖基)。

82、在某些治療性抗體，例如具有igg4恒定區(qū)的抗體中，擾亂可能產(chǎn)生對治療性抗體靶標(例如vla4)是單價的并且對另一個抗原是單價的雙特異性單克隆抗體。在一個實施方案中，所述抗體可消除擾亂或降低抗體對擾亂的易感性，從而降低pk/pd變異性。在某些實施方案中，所述抗體可增加二價單克隆抗體的效能并消除由于擾亂所致的雙特異性。在某些實施方案中，所述抗體可展現(xiàn)比其未突變對應物更高的結(jié)合親和力和/或顯示更高的持續(xù)受體占用率。

83、根據(jù)以下實施方式和權利要求書，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢將顯而易見。