本發(fā)明屬于病蟲害防治領域，涉及一種靶向lsatpsyn-β的dsrna及包含其的組合物，本發(fā)明還涉及所述dsrna及包含其的組合物用于防治煙草甲的應用。

背景技術(shù)：

1、煙草甲[lasioderma?serricorne(fabricius)]，屬鞘翅目(coleoptera)竊蠹科(anobiidae)，是世界性的貯煙害蟲，對于該害蟲的記載距今已有3000多年歷史。煙草甲是一種雜食性儲藏物害蟲，其寄主范圍廣泛，可嚴重危害儲藏的煙草及其制品、儲藏谷物及加工產(chǎn)品等，是一種世界性分布的倉儲害蟲。煙草甲主要通過幼蟲潛居寄主體內(nèi)進行蛀食，嚴重影響儲藏物的產(chǎn)量和品質(zhì)，其發(fā)生危害具有較強的隱蔽性。據(jù)美國農(nóng)業(yè)部估算，蟲害給全世界的煙草造成的損失高達1％。其中，以煙草甲的危害性最大，引起的質(zhì)量損失遠大于其他貯煙害蟲。煙草甲廣泛存在于烤煙、白肋煙、香料煙的煙葉、煙梗及各種卷煙制品中。它們不僅蛀食煙葉，使煙葉表面產(chǎn)生孔洞，造成破碎、殘缺不全、穿孔等癥狀，導致煙葉出片率、成絲率下降，嚴重時葉片被食光，只剩葉脈，嚴重影響煙葉的可用性，而且還排出大量糞便，產(chǎn)生異味，留下蟲尸，污染煙葉和煙草制品，極大地降低了卷煙的品質(zhì)。由其造成的油漬煙、蟲煙等問題受消費者的關注度非常高，極易引起消費者投訴，影響到商業(yè)信譽，由此給煙草行業(yè)造成無法估量的間接損失。

2、煙草甲的危害幾乎伴隨煙草制品生產(chǎn)的各個階段，其防治手段形式多樣，主要方法包括清潔防治、物理防治、生物防治及化學防治。防治研究主要集中在植物提取物和精油、bt毒蛋白、輻射、氣調(diào)、溫控防治等方式。由于化學防治簡便易行，因此當前仍為國內(nèi)外煙草行業(yè)控制煙草甲等儲煙害蟲的主要手段。我國煙草甲的防治主要以化學藥劑熏蒸為主，使用較多的熏蒸劑是溴甲烷和磷化氫。溴甲烷熏蒸曾經(jīng)是防治煙草甲的主要技術(shù)手段，但由于其對大氣臭氧層的破壞作用已被禁止使用。目前，全世界對儲煙害蟲大多采用磷化氫(ph3)熏蒸防治。但由于磷化氫的長期不合理使用，害蟲對其產(chǎn)生了嚴重的抗藥性，在有些情況下甚至會造成熏蒸防治失敗。1994年首次報道了煙草甲對ph3產(chǎn)生抗藥性的現(xiàn)象，同時，印度發(fā)生了第一例磷化氫熏蒸失敗。zettler等對其抗藥性作了研究，發(fā)現(xiàn)美國北卡州有1/2煙草倉庫中的煙草甲對磷化氫具有不同程度的抗藥性，有的表現(xiàn)出高度抗性。同時，化學防治導致的藥劑殘留、環(huán)境污染對食品安全和人類安全存在隱患等諸多弊端也已引起人們的高度關注。隨著近年來綠色煙草制品和有機煙草制品概念的出現(xiàn)，對煙草制品生產(chǎn)各個環(huán)節(jié)中有害物質(zhì)的控制將會日趨嚴格，用化學藥劑熏蒸煙葉防治煙草甲的方法將面臨前所未有的挑戰(zhàn)。因此，煙草行業(yè)迫切需要尋求更為安全的、與環(huán)境相容性好的、非化學的煙草甲防治方式。

3、rnai(rna?interference)即rna干擾，在轉(zhuǎn)錄后通過rna調(diào)控基因表達，在真核細胞中引入雙鏈rna(dsrna)分子從而導致具有序列同源性的基因產(chǎn)生特異性基因沉默(genesilencing)的現(xiàn)象。當真核細胞內(nèi)出現(xiàn)雙鏈rna，胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶dicer便將其切割成長度為21-23bp的小片段rna(sirna)。在rna解旋酶的作用下，sirna雙鏈被解開形成正義鏈和反義鏈。此刻出現(xiàn)的反義鏈隨后與內(nèi)切、外切酶及解旋酶等結(jié)合形成具有核酸酶功能的rna誘導的沉默復合物(rna-induced?silencing?complex，risc)。risc與mrna中的同源區(qū)特異性結(jié)合并在與sirna反義鏈互補結(jié)合的兩端切割mrna。mrna一旦被切割便立即被降解。通過這種方式，dsrna引發(fā)了細胞對其同源靶基因rna的降解反應。如果用特異的dsrna喂食或者注射害蟲，dsrna可以被害蟲的腸道吸收，然后被害蟲細胞內(nèi)的核酸酶切割成小的sirna，可以干擾與之序列一致的害蟲基因的正常功能，從而殺死害蟲。由于rnai具有高效性和高度特異性，所以dsrna被認為是一種非常特異的“殺蟲劑”。

4、孟山都公司研發(fā)的基于rnai的biodirecttm技術(shù)在害蟲防治領域顯示了不可忽略的前景。該技術(shù)利用植物病蟲害中與生長發(fā)育等相關的重要靶基因作為靶標，合成制備特定的dsrna噴霧劑，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中病蟲害防治。早期的測試表明，采用biodirect技術(shù)制造的殺蟲劑防治科羅拉多金花蟲非常有效，而瓢蟲等益蟲則不受影響。mitter等通過將cmv-2b基因的dsrna分子與黏土納米顆粒ldh緊密結(jié)合，制備bioclay噴霧劑可以讓rnai長達20天停留在植物葉面，從而完成對cmv-2b基因的沉默，達到抗cmv病毒的目的。該項技術(shù)同樣也可應用于抗蟲生產(chǎn)領域。

5、針對dsrna用于煙草甲的生物防治，發(fā)明專利cn107586785a公開了煙草甲幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因的dsrna在煙草甲防治中的應用，但幼齡幼蟲在注射dsrna?15天后死亡率僅為76％左右，且其dsrna需要通過顯微注射送至煙草甲體內(nèi)，在生產(chǎn)中實際應用難度較大。因此，生產(chǎn)上急需開發(fā)對煙草甲致死率高且便于應用的dsrna。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明人經(jīng)過大量研究，發(fā)現(xiàn)了一種靶向lsatpsyn-β的dsrna，并由此提供了用于防治煙草甲的組合物及方法。

2、dsrna

3、在一個方面，本發(fā)明提供了一種dsrna，所述dsrna包含正義鏈和反義鏈，其中，所述正義鏈包含如seq?id?no:1所示的核苷酸序列。

4、在一些實施方案中，所述dsrna靶向lsatpsyn-β基因。

5、在一些實施方案中，所述反義鏈與所述正義鏈至少部分互補。

6、所述至少部分互補是指兩條序列可以是完全互補的，或者總體上不多于6個、5個、4個、3個、2個或1個錯配堿基配對，同時保留了在相關條件下雜交的能力。本領域技術(shù)人員能夠根據(jù)雜交的核苷酸的最終應用來確定最適用于測試兩條序列的互補性的條件。此類條件可以是嚴格條件，例如400mm?nacl，40mm?pipes?ph?6.4，1mm?edta，50℃或70℃進行12-16小時，接著進行洗滌。其它條件，例如在生物體內(nèi)可能遇到的生理相關條件也可應用。

7、在一些實施方案中，所述正義鏈與所述反義鏈有不超過6個核苷酸堿基的錯配。在一些實施方案中，所述正義鏈與所述反義鏈有不超過5個核苷酸堿基的錯配。在一些實施方案中，所述正義鏈與所述反義鏈有不超過4個核苷酸堿基的錯配。在一些實施方案中，所述正義鏈與所述反義鏈有不超過3個核苷酸堿基的錯配。在一些實施方案中，所述正義鏈與所述反義鏈有不超過2個核苷酸堿基的錯配。在一些實施方案中，所述正義鏈與所述反義鏈有不超過1個核苷酸堿基的錯配。在一些實施方案中，所述正義鏈與所述反義鏈完全互補。

8、在一些實施方案中，所述反義鏈包含具有與seq?id?no:1所示的核苷酸序列至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％)互補性的核苷酸序列。

9、在一些實施方案中，所述反義鏈包含如seq?id?no:1所示的核苷酸序列的互補序列。

10、在一些實施方案中，所述dsrna包含的核苷酸各自獨立地選自天然核苷酸或修飾核苷酸。

11、混合物

12、另一方面，本發(fā)明提供了混合物，其包含由本發(fā)明所述的dsrna經(jīng)核酸內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的sirna。

13、在一些實施方案中，所述sirna包含正義鏈和反義鏈，并且所述正義鏈包含seq?idno:1所示的核苷酸序列中第1-439位核苷酸中任意位置起始的至少14個連續(xù)核苷酸。

14、在一些實施方案中，所述核酸內(nèi)切酶是dicer核酸內(nèi)切酶。

15、在一些實施方案中，所述切割在體外進行。

16、組合物

17、另一方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含本發(fā)明所述的dsrna或混合物，以及一種或多種輔助劑。

18、在一些實施方案中，所述輔助劑包括載體和/或助劑。

19、在一些實施方案中，所述載體選自水、溶劑或填料。

20、在一些實施方案中，所述載體為糖溶液。

21、在一些實施方案中，所述助劑選自以下的一種或多種：乳化劑、分散劑、潤濕劑、分散介質(zhì)、滲透劑、防凍劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、崩解劑、消泡劑、抗微生物劑、抗氧化劑、抗再沉積劑、漂白劑、著色劑、酶、脂肪、熒光物質(zhì)、殺真菌劑、水溶助長劑、保濕劑、光學增白劑、香料載體、香料、防腐劑、蛋白質(zhì)、有機硅、土壤釋放劑、增溶劑、糖衍生物等。

22、在一些實施方案中，所述組合物還包含一種或多種選自以下的組分：殺蟲劑、誘蟲劑、除草劑和植物生長調(diào)節(jié)劑。

23、在一些實施方案中，所述組合物是固體、液體或半固體。

24、在一些實施方案中，所述組合物可以配制成選自以下的任何一種劑型：混懸劑、溶液、粉劑、顆粒劑、注射劑(包括注射液、注射用無菌粉末與注射用濃溶液)、噴霧劑。

25、制備方法

26、本發(fā)明所述的dsrna可以通過本領域已知的任何方法制備，例如體外轉(zhuǎn)錄法、固相合成和液相合成等，其中，固相合成和液相合成均已有商業(yè)化訂制服務。

27、另一方面，本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明所述的dsrna的方法，其包括：

28、(1)提供煙草甲的總rna，反轉(zhuǎn)錄得到煙草甲的cdna；

29、(2)以(1)中獲得的煙草甲cdna為模板，使用序列分別如seq?id?no:2-5所示的引物進行pcr擴增；

30、(3)以(2)中獲得的擴增產(chǎn)物為模板進行體外轉(zhuǎn)錄以獲得所述dsrna的正義鏈和反義鏈；

31、(4)將所述正義鏈和反義鏈退火得到所述dsrna。

32、在一些實施方案中，在步驟(2)中，使用序列分別如seq?id?no:2、5所示的引物進行pcr擴增，以獲得所述dsrna的正義鏈轉(zhuǎn)錄模板；使用序列分別如seq?id?no:3、4所示的引物進行pcr擴增，以獲得所述dsrna的反義鏈轉(zhuǎn)錄模板；在步驟(3)中，由正義鏈轉(zhuǎn)錄模板和反義鏈轉(zhuǎn)錄模板分別經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得正義鏈和反義鏈。

33、在一些實施方案中，步驟(3)包括使用t7?rna聚合酶。

34、在一些實施方案中，步驟(1)包括提取煙草甲的總rna。

35、應用

36、另一方面，本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的dsrna、混合物或組合物用于防治煙草甲的應用。在一些實施方案中，所述dsrna或組合物單獨使用，或與另外的誘蟲劑、殺蟲劑聯(lián)合使用。

37、另一方面，本發(fā)明還提供了一種防治煙草甲的方法，其包括：將本發(fā)明所述的dsrna、混合物或組合物與煙草甲侵擾的植物或其制品或煙草甲接觸。

38、在一些實施方案中，所述接觸包括向所述植物或其制品表面或所述煙草甲施用(例如噴灑、浸泡、飼喂)本發(fā)明所述的dsrna、混合物或組合物。

39、在一些實施方案中，所述植物或其制品選自煙草或其制品、谷物或其制品。在一些實施方案中，所述植物或其制品選自烤煙、白肋煙和/或香料煙的煙葉、煙梗及卷煙制品。

40、在一些實施方案中，所述dsrna或組合物單獨使用，或與另外的誘蟲劑、殺蟲劑聯(lián)合使用。

41、另一方面，本發(fā)明還提供了試劑盒，其包含序列分別如seq?id?no:2-5所示的引物。

42、在一些實施方案中，所述試劑盒用于制備本發(fā)明所述的dsrna。

43、在一些實施方案中，所述試劑盒通過使用序列分別如seq?id?no:2、5所示的引物制備本發(fā)明所述的dsrna的正義鏈。

44、在一些實施方案中，所述試劑盒通過使用序列分別如seq?id?no:3、4所示的引物制備本發(fā)明所述的dsrna的反義鏈。

45、術(shù)語定義

46、在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術(shù)名詞具有本領域技術(shù)人員所通常理解的含義。同時，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關術(shù)語的定義和解釋。

47、當本文使用術(shù)語“例如”、“如”、“諸如”、“包括”、“包含”或其變體時，這些術(shù)語將不被認為是限制性術(shù)語，而將被解釋為表示“但不限于”或“不限于”。

48、除非本文另外指明或根據(jù)上下文明顯矛盾，否則術(shù)語“一個”和“一種”以及“該”和類似指稱物在描述本發(fā)明的上下文中(尤其在以下權(quán)利要求的上下文中)應被解釋成覆蓋單數(shù)和復數(shù)。

49、在本文中，如無特別說明，大寫字母c、g、u、a、t表示核苷酸的堿基組成，包括修飾和未修飾的核苷酸。術(shù)語“修飾的核苷酸”是指獨立地具有經(jīng)修飾的核糖部分、經(jīng)修飾的核苷間鍵或經(jīng)修飾的堿基的核苷酸，涵蓋對核苷間鍵、核糖部分或堿基的取代、添加或去除(例如，使用官能團或原子)。

50、如本文中所使用的，術(shù)語“l(fā)satpsyn-β”是指，煙草甲atp合成酶β亞基。atp合成酶是在細胞內(nèi)催化atp合成的酶，其結(jié)構(gòu)包括f1和f0兩個功能單位，其中β亞基是f1的重要組件，包含atp合成和水解所需的催化位點。

51、如本文中所使用的，術(shù)語“dsrna”是指雙鏈核糖核苷酸。其主要來源于：(1)細胞內(nèi)產(chǎn)生的mrna在rna聚合酶的作用下，由一條單鏈的rna為模板合成一條雙鏈rna(dsrna)；(2)細胞內(nèi)的rna產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu)，經(jīng)核酸內(nèi)切酶切割后形成dsrna；(3)體外合成。dsrna在細胞內(nèi)經(jīng)過dicer核酸內(nèi)切酶切割后形成多個具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段rna，即sirna，進一步引發(fā)rnai現(xiàn)象。

52、如本文中所使用的，術(shù)語“sirna”意指能夠序列特異性地誘導rnai現(xiàn)象、由正義鏈和反義鏈構(gòu)成、并具有部分或完全互補的雙鏈結(jié)構(gòu)的rna分子?；パa雙鏈結(jié)構(gòu)的長度可以為14～30個堿基對，例如14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或21個堿基對，例如14～19個堿基對。

53、如本文中所使用的，如無特別說明，術(shù)語“互補”是指第一序列的寡核苷酸在一定條件下和第二序列的寡核苷酸雜交并形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力?！爸辽俨糠只パa”是指兩條序列可以是完全互補的，或者總體上不多于6個、5個、4個、3個或2個或1個錯配堿基配對，同時保留了在相關條件下雜交的能力。另外在兩個寡核苷酸設計成雜交時形成一個或多個單鏈突出端的情況下，就確定互補性而言，這類突出端不應當視作錯配。在本文中，就滿足以上雜交能力的要求時，“互補”序列還可以包括非watson(沃森)-crick(克里克)堿基對和/或從非天然的以及經(jīng)修飾的核苷酸形成的堿基對。此類非watson(沃森)-crick(克里克)堿基對包括但不局限于g：u搖擺堿基配對或hoogstein(胡格斯騰)堿基配對。對應地，在本文中，如無特別說明，“錯配”是指在雙鏈體分子中，對應位置的堿基并未以互補的形式配對存在。

54、本領域技術(shù)人員能夠根據(jù)雜交的核苷酸的最終應用來確定最適用于測試兩條序列的互補性的條件。此類條件可以例如是嚴格條件，例如400mm?nacl，40mm?pipes?ph?6.4，1mm?edta，50℃或70℃進行12-16小時，接著進行洗滌。其它條件，例如在生物體內(nèi)可能遇到的生理相關條件也可應用。

55、發(fā)明的有益效果

56、本發(fā)明提供了一種靶向煙草甲lsatpsyn-β基因的dsrna分子及其在防治煙草甲中的用途。利用本發(fā)明的dsrna分子防治煙草甲的方法，具有很高的煙草甲致死率，安全性高，與環(huán)境相容性好。同時本發(fā)明的dsrna分子可以通過飼喂的方式防治煙草甲，便于大規(guī)模應用，具有很高的實用性，應用前景好。