本發(fā)明屬于動態(tài)核酸納米，特別涉及一種基于dsn循環(huán)與per電路的多功能邏輯操作方法。

背景技術(shù)：

1、dna因其可預(yù)測的watson-crick堿基配對、卓越的數(shù)據(jù)存儲能力和微小的尺寸，已成為動態(tài)納米技術(shù)領(lǐng)域中多功能的構(gòu)建模塊。目前，dna已被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建邏輯運算、級聯(lián)電路和分子網(wǎng)絡(luò)，展示了其在分子納米工程和生物計算中的巨大潛力。此外，具有創(chuàng)新功能的分子信息計算系統(tǒng)的發(fā)展，可顯著增強其在生物醫(yī)學診斷中的應(yīng)用。尤其是分子邏輯電路在基于雜交的催化系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用，作為信號放大和信息處理的核心節(jié)點。dna鏈置換和基于酶的催化是調(diào)節(jié)分子相互作用和動力學的兩種強大機制。鏈置換不僅能以高效促進酶促反應(yīng)，還提供了實現(xiàn)dna計算的多功能工具箱，適用于廣泛的邏輯操作。隨著時間的推移，利用這些機制開發(fā)的眾多dna計算系統(tǒng)在智能生物學、化學合成、多重生物分子條形碼及核酸與非核酸生物標志物的綜合分析中得到了廣泛的應(yīng)用。

2、盡管在基于dna邏輯門的生物醫(yī)學應(yīng)用方面取得了巨大進展，但其計算功能通常受到序列設(shè)計復雜性及多輸入輸出間平行信號串擾的限制。而利用多臂連接rna結(jié)構(gòu)的分子邏輯策略能夠有效調(diào)節(jié)基因表達，消除了輸入rna序列的約束，并減少了多輸入基本邏輯門(and和or)的輸出序列干擾。然而，由于多臂結(jié)構(gòu)固有的保守雙鏈性質(zhì)，該方法在涉及級聯(lián)電路的應(yīng)用中仍然存在一定的局限性。此外，已提出了幾種方法以減少dna電路中的平行信號串擾，通過純化dna鏈等方法只能對這一問題進行有限的控制。更為有效的策略包括引入四向分支遷移、發(fā)夾鎖、dna錯配和鎖核酸等調(diào)控元件，以減少由dna呼吸和/或波動引起的信號串擾。然而，這些抗串擾方法僅適用于有限子集的dna邏輯電路，并在多輸入輸出級聯(lián)電路所需的序列設(shè)計靈活性方面仍然受到限制。

3、引物交換反應(yīng)(per)作為一種等溫擴增技術(shù)，通過dna聚合酶和精確的引物序列介導的延伸和鏈置換反應(yīng)級聯(lián)，能夠高效地合成具有重復序列的用戶指定單鏈dna(ssdna)。per已被證明是一種可靠且可編程的工具，用于制造dna邏輯電路并開發(fā)智能dna設(shè)備。在此，本發(fā)明利用雙鏈特異性核酸酶(dsn)輔助目標循環(huán)結(jié)合per擴增電路(dsn-per)實現(xiàn)多功能分子邏輯。與分子信標探針(mbp)相比，使用連接到磁珠(mbs)的線性dna探針可以有效減少dsn的不必要切割反應(yīng)和呼吸波動。此外，本發(fā)明對鏈設(shè)計要求最低，可檢測與乳腺癌相關(guān)microrna。重要的是，該發(fā)明能夠響應(yīng)不同mirna的特定模式，建立常見的邏輯運算(yes、not、or、inhibit、and和nor)以及層次電路操作(or-and)。我們預(yù)見，本方法有望成為探索動態(tài)核酸納米技術(shù)中創(chuàng)新概念和策略的有前景的工具。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對構(gòu)建復雜級聯(lián)和分層dna網(wǎng)絡(luò)中通常產(chǎn)生難以忽視的信號泄露的問題，通過分析級聯(lián)鏈置換的內(nèi)在泄漏途徑，提供了一種基于dsn循環(huán)與per電路的多功能邏輯操作方法，用于動態(tài)mirnas分析。

2、本發(fā)明是一種多功能邏輯操作方法，包括：

3、(1)dna樣品的制備：所有dna寡核苷酸均溶解于te緩沖液(10mm?tris·hcl,1mmedta,ph?8.0)中，濃度為10μm，并在使用前存儲于-20℃。所有dna復合物均在tm緩沖液(10mm?tris-hcl,1mm?edta,12.5mm?mgcl2,ph?8.0)中組裝。本研究中使用的各個引物交換反應(yīng)(per)發(fā)夾(hp)和“啞鈴”發(fā)夾(dbhp)均在t100熱循環(huán)pcr儀(bio-rad)中進行退火處理。樣品首先加熱至95℃孵育5分鐘，然后以0.1℃/s的恒定速率緩慢冷卻至20℃。一旦退火完成，所有預(yù)制組件均在4℃條件下存儲以備后續(xù)使用；

4、(2)磁珠與核酸的偶聯(lián)：將鏈霉親和素磁珠(mb)輕輕渦旋以確保完全懸浮。為了去除保存劑，使用磁分離后將50μl的4mg/ml鏈霉親和素磁珠用緩沖液a(50mm?tris-hcl,5mmmgcl2,1mm?dtt,ph8.0)洗滌兩次。將上清液小心吸出后，磁珠重新懸浮于緩沖液a中。為制備磁珠-捕獲探針(cp)偶聯(lián)物，將15μl的10μm各類型cp加入磁珠溶液中，并在55℃的滾動混合器中孵育60分鐘。隨后，將獲得的mb-cp偶聯(lián)物用緩沖液b(50mm?tris-hcl,5mm?mgcl2,1mm?dtt,0.05％tween-20,ph?8.0)洗滌三次以去除過量探針，并重新懸浮于200μl的緩沖液a中。

5、所述步驟(1)中普通發(fā)夾的退火后終濃度是5μm。

6、所述步驟(1)中“啞鈴”發(fā)夾的退火后終濃度是5μm。

7、所述步驟(1)中dna寡核苷酸終濃度是10μm。

8、所述步驟(2)中磁吸時間為1min。

9、所述步驟(2)中磁珠-核酸的偶聯(lián)最佳溫度為55℃。

10、所述步驟(2)中磁珠-核酸的偶聯(lián)時間為60min。

11、所述步驟(2)中進行磁珠洗滌時需加入緩沖液的體積為200μl。

12、本發(fā)明通過整合兩種關(guān)鍵反應(yīng)機制——dsn輔助的靶標循環(huán)和per擴增電路來設(shè)計多功能分子邏輯電路。在本發(fā)明中，mirna首先由組裝在磁珠表面的捕獲探針識別。dsn切割修飾mbs上形成的dna-rna雜合體，釋放循環(huán)利用的mirna和大量“條形碼”序列。在磁分離后，自由引物與發(fā)夾結(jié)構(gòu)上的引物結(jié)合域雜交，并在bst聚合酶的協(xié)助下繼續(xù)擴增，直至到達指定的終止位點。hp序列域的5'端通過鏈置換與延伸產(chǎn)物競爭，并通過分支遷移釋放延伸產(chǎn)物。釋放的延伸產(chǎn)物的3'端與引物相同，從而啟動下一輪per。這些不同長度的ssdna產(chǎn)物富含g堿基，在存在k+的情況下折疊成g-四鏈體(g4)結(jié)構(gòu)。加入tht染料后，g4/tht復合物產(chǎn)生顯著的熒光強度。由于“條形碼”的序列設(shè)計獨立于相應(yīng)的目標結(jié)合位點，這使得配置具有極小限制的靈活性。這種獨立性賦予了構(gòu)建多樣化分子邏輯電路的能力，用于各種模式的智能mirna分析。

13、page分析首先用于驗證磁珠-核酸組裝以及yes邏輯操作可行性(附圖1)。第1和第2泳道分別含有cp和mir-21。加入dsn后，相較于無mir-21情況下的泳道4，泳道3中出現(xiàn)了遷移率較低的條帶，表明dsn在dna/rna雜合雙鏈中選擇性地消化了cp。當cp與磁珠結(jié)合后，與裸磁珠(泳道5)相比，泳道6中沒有出現(xiàn)對應(yīng)于cp的明顯條帶。隨后，在加入mir-21和dsn并進行磁分離后，泳道7中出現(xiàn)了對應(yīng)于dsn切割產(chǎn)物的條帶，而在泳道8中未觀察到任何條帶，證明了cp的成功組裝以及dsn輔助的目標循環(huán)在磁珠表面的有效性。進一步引入hp以啟動per擴增電路。與泳道9和11相比，泳道10中觀察到多個具有高分子量的低遷移率條帶，表明在目標存在的情況下，通過per產(chǎn)生了不同長度的g4聚合物序列。

14、為了進一步驗證yes邏輯門的性能，我們收集了熒光發(fā)射光譜結(jié)果(附圖2)。將目標的存在定義為輸入1，而目標的缺失定義為輸入0。閾值通過計算最大背景響應(yīng)的平均值并加上其標準偏差(sd)的十倍來確定。如果輸出熒光強度大于閾值，則定義為“1”；否則定義為“0”。，在缺少mir-21的情況下，空白對照系統(tǒng)僅表現(xiàn)出輕微的熒光強度，證實磁分離有效地維持了低背景信號。相比之下，在存在mir-21的情況下，在487nm處觀察到顯著的熒光峰，表明發(fā)生了由dsn-per介導的級聯(lián)放大。因此，輸入1產(chǎn)生輸出1，而輸入0產(chǎn)生輸出0，成功構(gòu)建了一個“yes”邏輯門。

15、接下來，我們利用yes邏輯門評估了該邏輯操作系統(tǒng)的分析性能(附圖3)。我們引入了兩個額外的傳感系統(tǒng)：集成了dsn循環(huán)和per電路的分子信標探針(mbp-dsn-per)以及直接耦合per電路的mbp(mbp-per)。結(jié)果顯示，與dsn-per相比，mbp-dsn-per系統(tǒng)表現(xiàn)出更高的熒光強度和背景，且信噪比(s/n)mbp-dsn-per(2.847)<s/n?dsn-per(20.152)。這一現(xiàn)象歸因于在洗滌過程中mbs表面連接的線性cp的耗損及兩種不期望路徑的泄漏。在缺乏dsn和目標的情況下，mbp-per的熒光強度顯著低于在存在dsn但缺乏目標時觀察到的mbp-dsn-per(s/n?mbp-per＝2.464)。事實上，生成的背景熒光強度主要歸因于單獨由dna呼吸引發(fā)的泄漏，這表明dsn在9bp長度的發(fā)夾內(nèi)的短雙鏈中仍保留了一定的活性。相比之下，mbs-cp偶聯(lián)物和磁性分離顯著提高了dsn-per操作的信噪比，這表明dsn-per在mirnas分析和邏輯門構(gòu)建中具有優(yōu)越性。

16、接下來我們評估了該方法的熒光響應(yīng)目標mir-21濃度變化的線性關(guān)系(附圖4)。隨著mirnas濃度從0增加到50nm，熒光強度逐漸增強。熒光強度與mirnas濃度之間的線性關(guān)系在100fm到50nm的范圍內(nèi)得到了良好呈現(xiàn)。該強大擴增性能歸因于有效的dsn切割循環(huán)和per電路的強大信號放大能力。

17、通過熒光響應(yīng)信號對該系統(tǒng)的檢測特異性實現(xiàn)了進一步驗證(附圖5)。在非目標物質(zhì)存在的情況下，熒光強度變化極小。這表明了由于dsn的雙鏈特異性而具有的出色選擇性，其對錯配或發(fā)夾環(huán)的活性極

18、由于自由設(shè)計的“條形碼”與目標結(jié)合序列無關(guān)，為構(gòu)建邏輯運算提供了顯著的設(shè)計靈活性。yes和not邏輯門是基本的邏輯系統(tǒng)，構(gòu)成了更復雜邏輯架構(gòu)的基礎(chǔ)。在構(gòu)建了yes邏輯門之后，我們通過在not-cp21序列中插入互補引物(cpp)設(shè)計了一個not邏輯門(附圖6)。在存在mir-21的情況下，dsn切割反應(yīng)產(chǎn)生了多個cpp，這些cpp通過形成完整的雙鏈結(jié)構(gòu)阻斷了引物2，并阻礙了per擴增操作。相比之下，在沒有mir-21的情況下，dsn切割反應(yīng)無法被觸發(fā)，允許游離的引物2直接與hp結(jié)合，并啟動per擴增電路以合成g4串聯(lián)結(jié)構(gòu)。熒光強度結(jié)果顯示，輸出結(jié)果滿足not邏輯門的真值表，即輸入為1時，輸出為0；輸入為0時，輸出為1。

19、以mir-21和mir-96為輸入，我們進一步構(gòu)建了一個or邏輯門(附圖7)。or-cp的序列經(jīng)過專門設(shè)計，能夠識別mir-21和mir-96。值得注意的是，dsn消化反應(yīng)生成的條形碼在mir-21和mir-96中共享相同的引物序列。因此，無論是mir-21還是mir-96都可以激活dsn輔助的目標循環(huán)，隨后通過釋放的引物驅(qū)動per擴增電路。在存在mir-21或/和mir-96的情況下，一種或兩種rna/dna雙鏈均被dsn消化，導致通過per激活合成g4串聯(lián)體，這可以通過明顯的熒光強度得到證實。只有當mir-21和mir-96均不存在時，才沒有觀察到顯著的熒光。因此，每當任一輸入存在時((1,0)、(0,1)、(1,1))，輸出總為1；而當兩者均不存在時((0,0))，輸出為0，表明mir-21和mir-96之間存在典型的“或”關(guān)系。

20、我們還利用mir-21和mir-96作為輸入構(gòu)建了一個inhibit邏輯門(附圖8)。在mir-21和mir-96均不存在的情況下，只有在mb-inhibit表面上形成的8個堿基對的dsdna是不穩(wěn)定的，難以觸發(fā)dsn切割反應(yīng)。在mir-21存在的情況下，inhibit-cp21與mir-21發(fā)生相互作用，導致dsn的切割。然而，釋放的自由cpp無法與hp結(jié)合，阻止了per擴增電路中g(shù)4串聯(lián)體產(chǎn)物的形成。在mir-96存在的情況下，inhibit-cp96與mir-96互補結(jié)合，誘導dsn切割反應(yīng)。隨后釋放的引物可以與hp結(jié)合，類似于yes邏輯門，啟動per擴增電路。當mir-21和mir-96同時存在時，由于釋放的延伸引物更傾向于與自由的cpp結(jié)合，從而抑制后續(xù)的per擴增操作。結(jié)果顯示，只有在一個輸入為0、另一個輸入為1時(0,1)，輸出為1，否則輸出為0，明確展示了“mir-21抑制mir-96”的模式。

21、為了增強邏輯門構(gòu)建的多功能性，我們設(shè)計了一種“啞鈴”發(fā)夾(dbhp)來調(diào)控per擴增電路，以構(gòu)建and邏輯門(附圖9)。只有在mir-21和mir-96同時存在的情況下，dsn切割反應(yīng)才能同時生成cdb和引物，導致dbhp的3'端打開，引物隨后與相應(yīng)區(qū)域結(jié)合，有效激活per擴增電路并產(chǎn)生增強的熒光強度。因此，只有在兩者均為1時(1,1)，輸出為1，而其他輸入(包括(0,0)、(1,0)和(0,1))均導致輸出為0，成功構(gòu)建了mir-21與mir-96之間的“and”關(guān)系。

22、接下來我們構(gòu)建了nor邏輯門(附圖10)中，nor-cp21中的條形碼序列被專門設(shè)計為與dbhp的環(huán)和莖區(qū)域的序列相同，稱為db，并與cdb互補。由mir-96釋放的條形碼被設(shè)計為cpp序列，該序列與引物2完全互補。當mir-21和mir-96均不存在時，現(xiàn)有的cdb會打開dbhp，允許引物2隨后與dbhp結(jié)合并啟動per擴增操作，合成g4串聯(lián)體以生成增強的熒光強度。構(gòu)建的nor邏輯門顯示，僅在輸入均為0(0,0)時，輸出為1，而在其他情況下((1,0)、(0,1)和(1,1))，輸出均為0。

23、為了進一步探索該邏輯操作方法的能力，我們提出了一個三輸入and邏輯門，選擇與乳腺癌相關(guān)的mir-21、mir-96和mir-190b作為輸入(附圖11)。結(jié)果顯示，只有在所有三個mirna均存在時才觀察到顯著的熒光信號，表明dsn切割產(chǎn)生的三個關(guān)鍵條形碼片段共同與dbhp結(jié)合，啟動per擴增操作。在沒有輸入或僅有一個或兩個mirna的情況下，dbhp的3'端無法完全打開，或者引物無法與對應(yīng)區(qū)域結(jié)合，從而抑制了per擴增操作。因此，在三輸入and邏輯操作中，只有在三個輸入均存在(1,1,1)時，輸出為1，而其他輸入組合((0,0,0)、(1,0,0)、(0,1,0)、(0,0,1)、(1,1,0)、(1,0,1)、(0,1,1))均產(chǎn)生輸出為0。

24、多個dna邏輯門的集成推動了多層電路的發(fā)展，使得更復雜的設(shè)備成為可能。為了使dsn-per系統(tǒng)能夠響應(yīng)復雜的mirna輸入模式，我們設(shè)計了串聯(lián)連接的or邏輯門和and邏輯門(附圖11)。mir-21或mir-96作為對應(yīng)的or邏輯門，兩者在mir-21和mir-96誘導下釋放的條形碼片段作為cdb，而由mir-190b誘導的條形碼片段則作為and邏輯門的引物。正如預(yù)期的那樣，加入所有三個輸入導致更高的熒光強度，表明與僅mir-21或mir-96與mir-190b的組合相比，cdb釋放和per激活均有所增加。此外，對于其他mirna輸入組合，檢測到的熒光強度較低。因此，在(mir-21ormir-96)and?mir-190b邏輯門中，輸入為(1,0,1)、(0,1,1)和(1,1,1)時，輸出為1，而輸入為(0,0,0)、(1,0,0)、(0,1,0)、(0,0,1)和(1,1,0)時，輸出為0。

25、綜上所述，本專利利用dsn輔助的目標循環(huán)和per擴增電路來執(zhí)行多功能邏輯操作。與傳統(tǒng)方法相比，mbs-cp共軛物有效減少了dsn的非特異性切割和dna呼吸波動的影響。此外，“條形碼”序列獨立于目標結(jié)合位點，適用于敏感檢測多種mirna。本發(fā)明能靈活編程多種邏輯電路，如yes、not、or、inhibit、and和nor。三輸入and和or-and邏輯電路展示了其多功能性。該設(shè)計為開發(fā)復雜反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)、智能納米器件和多功能計算平臺提供了一個有前景的工具。