本發(fā)明屬于生物材料與細(xì)胞培養(yǎng)交叉，具體涉及一種基于序貫溫控的復(fù)合多孔水凝膠微球制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、三維(3d)細(xì)胞培養(yǎng)相較于傳統(tǒng)的二維(2d)培養(yǎng)方式，更貼近生物體內(nèi)真實(shí)的組織結(jié)構(gòu)與細(xì)胞間復(fù)雜的相互作用，進(jìn)而為研究者提供一個(gè)更加精確的生物體內(nèi)微環(huán)境的模擬平臺(tái)。在進(jìn)行細(xì)胞行為的研究過(guò)程中，3d培養(yǎng)模式顯著優(yōu)于2d培養(yǎng)，它能更準(zhǔn)確地展現(xiàn)細(xì)胞遷移的動(dòng)態(tài)過(guò)程，并深刻揭示細(xì)胞間的協(xié)同作用機(jī)制。此外，3d培養(yǎng)技術(shù)還能有效減少細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中受到的損傷，從而大幅度提高細(xì)胞的存活率，使細(xì)胞保持更好的生物活性和生理狀態(tài)。3d細(xì)胞培養(yǎng)的可操作性很強(qiáng)，可以根據(jù)不同細(xì)胞生存所需，為其提供更加適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。目前，已經(jīng)涌現(xiàn)出多種三維細(xì)胞培養(yǎng)的方法，如強(qiáng)制浮動(dòng)法、攪拌法以及支架法等。3d細(xì)胞培養(yǎng)在生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域均擁有廣泛的應(yīng)用前景，不僅為臨床治療提供了新的策略和手段，也為科學(xué)研究開(kāi)辟了新的方向。

2、水凝膠具有生物可降解性和良好的生物相容性，可用于模仿天然細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵特征，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化以及組織再生，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)受損組織的修復(fù)與重建。明膠、透明質(zhì)酸和膠原蛋白等都是很好的水凝膠支架材料，可用來(lái)進(jìn)行藥物遞送、促進(jìn)血管再生以及骨修復(fù)。明膠作為ph敏感的天然高分子蛋白質(zhì)，因其生物相容性、非免疫原性及低成本而被廣泛應(yīng)用。其精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)序列和基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp)敏感的位點(diǎn)可促進(jìn)細(xì)胞結(jié)合，支持細(xì)胞增殖。另外，利用明膠為基礎(chǔ)材料制備的微球(gmss)可作為藥物或細(xì)胞遞送的高效載體。但明膠降解速度較慢，力學(xué)性能較差，使得在使用明膠制備需保持穩(wěn)定形態(tài)和優(yōu)良力學(xué)性能的水凝膠生物支架時(shí)，面臨著許多困難和挑戰(zhàn)。殼聚糖由甲殼素衍生而來(lái)，是一種天然堿性陽(yáng)離子聚合物。利用殼聚糖制備的帶正電的生物支架可更好地吸引細(xì)胞黏附，有利于細(xì)胞黏附增殖。殼聚糖在制備緩釋材料和藥物載體方面具有天然優(yōu)勢(shì)，但其分子結(jié)構(gòu)中含有大量的羥基(-oh)和氨基(-nh2)活性基團(tuán)，這些基團(tuán)極易形成氫鍵而使得其水溶性較差，在大多數(shù)有機(jī)溶劑中均不溶解，極大地限制了殼聚糖的應(yīng)用。

3、在現(xiàn)有的研究中，已存在將明膠與殼聚糖聯(lián)合使用制備生物支架，以提高支架性能。但由于殼聚糖極不易溶，且明膠與殼聚糖的凝固點(diǎn)不同，在大多研究中均無(wú)法實(shí)現(xiàn)將明膠和殼聚糖均勻混合，多采用分層交聯(lián)的方式來(lái)整合二者的優(yōu)勢(shì)，這種方式無(wú)法將復(fù)合的優(yōu)勢(shì)完全發(fā)揮出來(lái)。另外，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)形狀中球形水凝膠比塊狀水凝膠擁有更大的比表面積，且尺寸小，更利于微組裝。攪拌法是最常見(jiàn)的水凝膠微球制備方法，其操作簡(jiǎn)單，對(duì)儀器要求低，便于大規(guī)模生產(chǎn)。但在利用攪拌法制備微載體的過(guò)程中，可控性較差，液滴的大小和分散性受混合的程度和時(shí)間的影響，微球很難控制其大小，對(duì)乳化劑的用量、各個(gè)階段的最適溫度和時(shí)間的準(zhǔn)確把控仍需進(jìn)一步探索。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明是為了針對(duì)在制備微載體的時(shí)候殼聚糖不易溶解，無(wú)法調(diào)控水凝膠微球的尺寸的技術(shù)問(wèn)題。

2、本發(fā)明提供一種基于序貫溫控的復(fù)合多孔水凝膠微球制備方法，所述制備方法的具體步驟如下：

3、步驟1：稱取0.2?-0.4g甲基丙烯酸酐改性明膠，溶于含體積分?jǐn)?shù)0.5％-2％光引發(fā)劑的2ml-4ml?1×pbs中獲得終濃度為10％-20％的明膠溶液；

4、步驟2：稱取0.01g-0.02g甲基丙烯酸酐改性殼聚糖，溶于含體積分?jǐn)?shù)0.5％-2％光引發(fā)劑的1ml-2ml?1×pbs中獲得終濃度為1％-2％的殼聚糖溶液；

5、步驟3：將步驟1獲得的明膠溶液與步驟2獲得的殼聚糖溶液置于37-50℃水浴中避光混合獲得混合溶液；

6、步驟4：將0.01g-0.1g乳化劑溶于步驟3獲得的混合溶液中，得到預(yù)聚液；

7、步驟5：將0.06g-0.24g乳化劑溶于15ml-60ml的石蠟油中，即得到含0.1％-0.4％span-80的油相溶液；

8、步驟6：將步驟4獲得的預(yù)聚液以0.1-1ml/min的速度緩慢滴入步驟5獲得的油相溶液中，并于20-22℃下400-1000rpm避光攪拌30-60min獲得w/o乳液，以100mw/cm2的光照強(qiáng)度，在405nm的藍(lán)光下暴露30s-5min進(jìn)行光固化，得到明膠微球；

9、步驟7：將步驟6獲得的微球進(jìn)行去油處理，然后置于-20℃下冷凍0-30min后移至-80℃下冷凍0-10min，最后置于液氮中速凍5-10min進(jìn)行梯度冷凍，并進(jìn)行凍干處理，得到明膠-殼聚糖復(fù)合多孔水凝膠微球。

10、進(jìn)一步地限定，步驟1中獲得甲基丙烯酸酐改性明膠的方法如下：

11、(1)稱取10g明膠溶于含100ml的1×pbs中；

12、(2)在50℃條件下400rpm攪拌30min以加速溶解；

13、(3)向其中緩慢加入5ml甲基丙烯酸酐反應(yīng)2h；

14、(4)將反應(yīng)后溶液倒入截留分子量為14kda的透析袋中，40℃下透析7d；

15、(5)對(duì)透析后的明膠進(jìn)行凍干處理，得到改性后明膠。

16、進(jìn)一步地限定，步驟2獲得甲基丙烯酸酐改性殼聚糖的方法如下：

17、(1)稱取1.5g殼聚糖溶于100ml的4％(v/v)冰醋酸中；

18、(2)室溫下攪拌12h以加速溶解；

19、(3)向其中緩慢加入6ml甲基丙烯酸酐于40℃下400rpm避光攪拌12h；

20、(4)將反應(yīng)后溶液倒入截留分子量為14kda的透析袋中，40℃下透析7d；

21、(5)對(duì)透析后的殼聚糖進(jìn)行凍干處理，得到改性后殼聚糖。

22、進(jìn)一步地限定，所述光引發(fā)劑為lap。

23、進(jìn)一步地限定，所述乳化劑為tween-60和span-80。

24、進(jìn)一步地限定，步驟7中的去油處理的方法為加入5ml丙酮清洗3次。

25、本發(fā)明提供一種上述的制備方法獲得的明膠-殼聚糖復(fù)合多孔水凝膠微球。

26、本發(fā)明提供一種上述的明膠-殼聚糖復(fù)合多孔水凝膠微球在以非診斷和治療為目的的制備生物支架中的應(yīng)用。

27、本發(fā)明提供一種上述的明膠-殼聚糖復(fù)合多孔水凝膠微球在以非診斷和治療為目的的培養(yǎng)細(xì)胞中的應(yīng)用。

28、本發(fā)明提供一種上述的明膠-殼聚糖復(fù)合多孔水凝膠微球在以非診斷和治療為目的的促進(jìn)血管生成或促進(jìn)成骨分化中的應(yīng)用。

29、將改性分為溶解階段、改性階段、純化階段及凍干階段四個(gè)階段，將微球制備分為溶解階段、乳化階段、固化階段及梯度冷凍階段四個(gè)階段，以上八個(gè)階段均有對(duì)溫度的控制，形成序貫溫控。

30、本發(fā)明提供了一種明膠和殼聚糖的改性方法，包括如下步驟：

31、s1、溶解階段：將明膠和殼聚糖在攪拌下溶解，其中明膠溶于1×pbs，溶解溫度約為4-50℃，優(yōu)選約50℃，溶解時(shí)間約為20-40min，優(yōu)選約30min。殼聚糖溶于冰醋酸，濃度為1-10％(v/v)，優(yōu)選在4％(v/v)冰醋酸下溶解，溶解溫度約為4-50℃，優(yōu)選約23℃，溶解時(shí)間約為12-48h，優(yōu)選為12h。

32、s2、改性階段：向s1溶液中緩慢滴入甲基丙烯酸酐，避光攪拌，溫度為37-50℃，優(yōu)選為40℃。其中，明膠溶液反應(yīng)時(shí)間為1-12h，優(yōu)選為2h。殼聚糖溶液反應(yīng)時(shí)間為12-48h，優(yōu)選時(shí)間為12h。

33、s3、純化階段：將s2所得溶液進(jìn)行純化處理，優(yōu)選透析法，透析溫度為37-50℃，優(yōu)選約40℃。

34、s4、凍干階段：將s3所得溶液進(jìn)行凍干處理，凍干時(shí)間3-7d，優(yōu)選約5d，得到改性后的明膠和殼聚糖。

35、本發(fā)明提供了上述明膠-殼聚糖多孔水凝膠微球的制備方法，包括如下步驟：

36、s1、溶解階段：將凍干后材料溶于pbs中，優(yōu)選溶解溫度為50℃，并加入光引發(fā)劑。

37、s2、乳化階段：將明膠和殼聚糖溶液按比例配置成預(yù)聚液，加入乳化劑，置于水浴鍋中充分溶解，優(yōu)選溫度為50℃。將預(yù)聚液緩慢滴入含乳化劑的油相中，避光攪拌，環(huán)境溫度為19-25℃，優(yōu)選為20-22℃。

38、s3、固化階段：對(duì)收集得到的w/o乳液進(jìn)行光固化處理，并對(duì)微球進(jìn)行清洗。

39、s4、梯度冷凍階段：將微球置于-20℃，-80℃及液氮中梯度冷凍，并進(jìn)行凍干處理，得到多孔微球。

40、有益效果：第一方面，該復(fù)合水凝膠微球球體透明，表面孔隙均勻，可降解，具有良好的生物相容性，可支持細(xì)胞的增殖黏附，圖6圖7均為生物相容性的數(shù)據(jù)支持。

41、第二方面，該微球集明膠與殼聚糖優(yōu)勢(shì)于一身，特別是具備了殼聚糖表面所攜帶的正電荷屬性，進(jìn)一步增強(qiáng)了微球?qū)?xì)胞的吸附能力，細(xì)胞吸附效果在熒光圖中即可觀察到。

42、第三方面，通過(guò)調(diào)整制備過(guò)程中乳化劑的用量，可控制微球粒徑大小為數(shù)十至數(shù)百微米，以適應(yīng)不同的組織工程需求。此外，本發(fā)明結(jié)合梯度冷凍技術(shù)，賦予了微球多孔結(jié)構(gòu)，增大了微球表面粗糙度和比表面積，從而為細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)提供了理想微環(huán)境?？刂瞥叽缈梢允沟梦⑶蜻m應(yīng)不同的組織工程需求，根據(jù)所使用的環(huán)境不同來(lái)選取不同尺寸的微球。尺寸的控制依賴于乳化劑的用量和攪拌時(shí)的環(huán)境溫度。大尺寸指未加乳化劑，僅通過(guò)改變攪拌溫度，使微球直徑在150-350μm之間，小尺寸則指加入乳化劑，并通過(guò)對(duì)溫度的把控，使得微球直徑在30-60μm之間，乳化劑是tween-60和span-80，石蠟油是為了提供油相環(huán)境。

43、第四方面，該微球可有效地促進(jìn)血管生成，在促進(jìn)成骨分化方面也有著潛在的應(yīng)用前景，在實(shí)施例中所用到的mc3t3-e1即小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞，目前該微球可支持該細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)細(xì)胞增殖。

44、將材料進(jìn)行改性處理，通過(guò)調(diào)整乳化劑的用量來(lái)控制微球尺寸，并實(shí)施序貫溫控以實(shí)現(xiàn)復(fù)合材料的相互融合，從而得到尺寸可調(diào)的勻相復(fù)合水凝膠微球，攪拌法是將水相置于油相中并通過(guò)物理攪拌使得水相被分散成小的液滴，后期經(jīng)過(guò)洗滌并除去油相，得到微載體，石蠟油是為了提供油相環(huán)境。