本發(fā)明涉及一種用于檢測meiob基因突變的引物組及其應(yīng)用、靶向meiob基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mrna的反義寡核苷酸分子及其應(yīng)用、靶向meiob蛋白的小分子及其應(yīng)用的，具體涉及一種meiob基因的突變檢測引物組、靶向其mrna的反義寡核苷酸以及針對meiob蛋白的小分子藥物及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、減數(shù)分裂的精準(zhǔn)完成對遺傳信息的穩(wěn)定傳遞至關(guān)重要。2013年，通過對小鼠模型的減數(shù)分裂蛋白組學(xué)研究，發(fā)明人(羅孟成)率先發(fā)現(xiàn)一種參與減數(shù)分裂i期前期同源染色體重組的單鏈dna結(jié)合蛋白meiob(meiosis?specific?with?ob?domain)。通過研究其功能發(fā)現(xiàn)meiob異常會導(dǎo)致雄性精子發(fā)育停滯在減數(shù)分裂i期前期和雌性卵泡早期凋亡；隨著對人源減數(shù)分裂相關(guān)蛋白研究的進(jìn)展，2014年發(fā)現(xiàn)meiob因具有癌癥高表達(dá)特性而被提名為新型癌癥抗原并有可能作為免疫治療的靶標(biāo)；2016年通過對19名睪丸癌患者的睪丸組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，證實meiob屬于極端高表達(dá)睪丸癌相關(guān)基因(extremely?highly?expressedct?genes,eectgs)；2017年通過對患有無精癥的同一家系中成員進(jìn)行全基因組測序，首次發(fā)現(xiàn)meiob突變作為遺傳致病因素；2019年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)家族性原發(fā)卵巢功能不全與人源meiob異常相關(guān)；2020年，通過對25人特發(fā)性少精癥或非梗阻性無精癥的隊列進(jìn)行ngs(next-generation?sequencing)分析，發(fā)現(xiàn)，多數(shù)人存在hmeiob基因序列異常；同年另一研究中，通過對147人的精子發(fā)生阻滯隊列進(jìn)行減數(shù)分裂相關(guān)基因的外顯子測序(exomesequencing)，發(fā)現(xiàn)部分患者攜帶hmeiob致病性基因變體。目前，多種hmeiob突變被解析出來，但基因突變的不確定性較高，未來還會出現(xiàn)新的突變模式。

2、綜上，通過檢測不孕不育患者meiob基因序列對明確特發(fā)性不孕不育的病因及靶向治療具有重要的臨床意義；通過靶向抑制meiob基因表達(dá)或蛋白功能可阻斷精子發(fā)生進(jìn)程，達(dá)到避孕效果。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于檢測meiob基因突變的引物組及其應(yīng)用，可檢測已發(fā)現(xiàn)的hmeiob基因突變位點(diǎn)和hmeiob基因中潛在的突變位點(diǎn)。

2、本發(fā)明的目的之二在于提供一種靶向meiob基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mrna的反義寡核苷酸分子及其應(yīng)用，可靶向結(jié)合hmeiob基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物而抑制其表達(dá)，其全硫代修飾提高了分子的穩(wěn)定性和半衰期，且分子本身無毒并可降解。

3、本發(fā)明的目的之三在于提供一種靶向meiob蛋白的小分子及其類似物及其應(yīng)用，可以用于阻斷meiob功能及精子形成，實現(xiàn)避孕效果，同時可用于降低腫瘤細(xì)胞中meiob蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞增殖能力，實現(xiàn)靶向治療。

4、本發(fā)明實現(xiàn)目的之一所采用的方案是：一方面，提供一種用于檢測meiob基因突變的引物組，可檢測已發(fā)現(xiàn)的hmeiob(人源meiob基因)基因突變位點(diǎn)和hmeiob基因中潛在的突變位點(diǎn)，包括以下引物對：

5、針對外顯子1的引物組的核苷酸序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示；

6、針對外顯子2的引物組的核苷酸序列如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示；

7、針對外顯子3的引物組的核苷酸序列如seq?id?no.5和seq?id?no.6所示；

8、針對外顯子4的引物組的核苷酸序列如seq?id?no.7和seq?id?no.8所示；

9、針對外顯子5的引物組的核苷酸序列如seq?id?no.9和seq?id?no.10所示；

10、針對外顯子6的引物組的核苷酸序列如seq?id?no.11和seq?id?no.12所示；

11、針對外顯子7的引物組的核苷酸序列如seq?id?no.13和seq?id?no.14所示；

12、針對外顯子8、9的引物組的核苷酸序列如seq?id?no.15和seq?id?no.16所示；

13、針對外顯子10的引物組的核苷酸序列如seq?id?no.17和seq?id?no.18所示；

14、針對外顯子11的引物組的核苷酸序列如seq?id?no.19和seq?id?no.20所示；

15、針對外顯子12的引物組的核苷酸序列如seq?id?no.21和seq?id?no.22所示；

16、針對外顯子13的引物組的核苷酸序列如seq?id?no.23和seq?id?no.24所示。

17、優(yōu)選地，所述引物組可以覆蓋人源meiob基因的整個外顯子及外顯子末端的內(nèi)含子。

18、所述引物組可以用于pcr反應(yīng)來擴(kuò)增hmeiob的不同外顯子序列，不同序列可以覆蓋hmeiob基因的整個外顯子及每個外顯子末端的內(nèi)含子。

19、另一方面，提供一種含有所述的引物組的檢測人源meiob基因突變的試劑盒。

20、具體的，提供一種含有所述的引物組的檢測非梗阻性無精癥或早發(fā)性卵巢功能不全的試劑盒。

21、本發(fā)明實現(xiàn)目的之二所采用的方案是：一方面，提供一種靶向meiob基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mrna的反義寡核苷酸分子，其為單鏈dna，核苷酸序列為：atttatcgtgcagcccaaagt，序列長度為21bp，兩端各有3個鎖核酸，修飾方式為全硫代修飾。

22、優(yōu)選地，所述反義寡核苷酸分子通過堿基互補(bǔ)識別mrna，抑制meiob蛋白的表達(dá)。

23、另一方面，提供一種所述的靶向meiob基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mrna的反義寡核苷酸分子的應(yīng)用，通過將所述反義寡核苷酸分子與培養(yǎng)基共孵育的方式降低細(xì)胞中meiob基因的mrna含量，或通過睪丸注射所述反義寡核苷酸分子的方式來降低睪丸中meiob基因的mrna含量。

24、具體的，提供一種所述的靶向meiob基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mrna的反義寡核苷酸分子的應(yīng)用，通過將所述反義寡核苷酸分子與培養(yǎng)基共孵育的方式降低細(xì)胞中hmeiob基因的mrna含量。

25、或者，提供另一種所述的靶向meiob基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mrna的反義寡核苷酸分子的應(yīng)用，通過睪丸注射所述反義寡核苷酸分子的方式來降低小鼠睪丸中mmeiob基因(小鼠meiob基因)的mrna含量，給藥方式為陰囊局部注射，給藥劑量為0.33nmol/g，觀察時長為72小時。

26、具體的，用于制備抑制meiob基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mrna的表達(dá)或抑制meiob蛋白的表達(dá)的產(chǎn)品。

27、本發(fā)明實現(xiàn)目的之三所采用的方案是：一種靶向meiob蛋白的小分子及其類似物，其分子結(jié)構(gòu)如下所示的至少一種，

28、

29、優(yōu)選地，所述靶向meiob蛋白的小分子可以通過結(jié)合meiob蛋白來抑制meiob與spata22的結(jié)合。

30、優(yōu)選地，所述靶向meiob蛋白的小分子及其類似物與meiob蛋白結(jié)合是可逆的，隨著濃度降低可迅速從meiob蛋白表面解離。

31、另一方面，提供一種所述的靶向meiob蛋白的小分子及其類似物的應(yīng)用，通過口服或陰囊皮下局部注射靶向meiob蛋白的小分子及其類似物來抑制睪丸中精子的產(chǎn)生。

32、一種所述的靶向meiob蛋白的小分子及其類似物的應(yīng)用，用于制備抑制細(xì)胞中meiob與spata22的結(jié)合或抑制睪丸中精子的產(chǎn)生的產(chǎn)品。

33、一種所述的靶向meiob蛋白的小分子及其類似物的應(yīng)用，用于制備避孕藥物。

34、一種所述的靶向meiob蛋白的小分子及其類似物的應(yīng)用，用于制備抗meiob高表達(dá)腫瘤藥物。

35、本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

36、本發(fā)明提供的引物組可以擴(kuò)增包含外顯子兩側(cè)各100bp堿基的內(nèi)含子序列，故可用于檢測因外顯子末端內(nèi)含子突變導(dǎo)致的異常剪接體的產(chǎn)生，在除了識別已有的所有突變類型外，還可用于檢測新發(fā)未知突變。

37、本發(fā)明提供的(靶向meiob基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mrna的反義寡核苷酸分子)aso分子可靶向結(jié)合meiob基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物而抑制其表達(dá)，其全硫代修飾提高了分子的穩(wěn)定性和半衰期，且分子本身無毒并可降解。

38、本發(fā)明提供的meiob蛋白靶向小分子具有抑制meiob與spata22結(jié)合的能力，可以阻止精子產(chǎn)生，實現(xiàn)避孕效果。