本發(fā)明屬于生物，涉及一種逆轉錄酶突變體及其制備方法和應用。

背景技術：

1、逆轉錄酶(reverse?transcriptase，rt)是負責rna病毒基因組復制的酶，具有rna和dna依賴性dna聚合酶(以rna或dna為模板合成cdna的能力)和rna酶h活性(降解rna/dna雜交鏈中rna鏈的活性)。目前，分子生物學中大多數逆轉錄酶來源于莫洛尼鼠白血病病毒(moloney?murine?leukemia?virus，mmlv)，其是分子量為75kda的單體結構酶，最適反應溫度約為37℃，反應時間一般是15-30min。

2、rt-qpcr是目前分子診斷領域最重要的技術之一，其第一步是將rna模板逆轉錄生成cdna，再以合成的cdna為模板進行實時熒光pcr反應，逆轉錄反應時間的縮短也能促進快速rt-qpcr產品的開發(fā)，增加儀器的流轉率。

3、cn112795549a公開了一種逆轉錄酶突變體，具體地，此發(fā)明構建了逆轉錄酶(m-mlv)突變庫，通過逐步篩選，最終篩選出了熱穩(wěn)定性提高且擴增效率較高的突變體(逆轉錄酶突變體mu_15)。在高溫條件下(58℃)，與野生型相比，此發(fā)明的逆轉錄酶突變體mu_15的逆轉錄效率提高了39.67倍，但是反應時間較長。

4、因此，在分子診斷領域亟需一種能高效快速合成cdna的逆轉錄酶。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術的不足和實際需求，本發(fā)明提供一種逆轉錄酶突變體及其制備方法和應用，本發(fā)明在野生型mmlv逆轉錄酶的基礎上，根據其結構特征及其關鍵氨基酸位點進行理性設計，通過定點突變是篩選得到新的逆轉錄酶，將具有不同優(yōu)良性能的突變株性能結合，得到一系列高效快速的逆轉錄酶，逆轉錄反應時間可縮短至5min，更適合用于一步法rt-qpcr。

2、為達到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種逆轉錄酶突變體，所述逆轉錄酶突變體在野生型氨基酸序列seq?id?no.1的基礎上發(fā)生包括如下位點突變中的任意一種或至少兩種的組合：d524n、e123k、k259d或q466r。

4、本發(fā)明根據野生型mmlv逆轉錄酶已有的結構研究，通過其結構特征及關鍵氨基酸位點進行理性設計，通過定點突變篩選得到一系列更高效的逆轉錄酶，相較于野生型mmlv逆轉錄酶的15-30min，本發(fā)明逆轉錄酶突變體合成cdna時間僅為5min，進一步縮短了rt-qpcr的全流程時間，增加儀器的使用效率，促進一步法rt-qpcr產品的開發(fā)，在分子診斷領域具有廣泛的應用場景。

5、本發(fā)明提供mmlv逆轉錄酶突變體是在全長為671個氨基酸的野生型mmlv逆轉錄酶的氨基酸序列(ncbi，登陸號為np_955591)即seq?id?no.1基礎上進行氨基酸位點的突變。

6、seq?id?no.1：

7、mtlniedehrlhetskepdvslgstwlsdfpqawaetggmglavrqapliiplkatstpvsikqypmsqearlgikphiqrlldqgilvpcqspwntpllpvkkpgtndyrpvqdlrevnkrvedihptvpnpynllsglppshqwytvldlkdaffclrlhptsqplfafewrdpemgisgqltwtrlpqgfknsptlfdealhrdladfriqhpdlillqyvddlllaatseldcqqgtrallqtlgnlgyrasakkaqicqkqvkylgyllkegqrwltearketvmgqptpktprqlreflgtagfcrlwipgfaemaaplypltktgtlfnwgpdqqkayqeikqalltapalglpdltkpfelfvdekqgyakgvltqklgpwrrpvaylskkldpvaagwppclrmvaaiavltkdagkltmgqplvilaphavealvkqppdrwlsnarmthyqallldtdrvqfgpvvalnpatllplpeeglqhncldilaeahgtrpdltdqplpdadhtwytdgssllqegqrkagaavtteteviwakalpagtsaqraelialtqalkmaegkklnvytdsryafatahihgeiyrrrglltsegkeiknkdeilallkalflpkrlsiihcpghqkghsaeargnrmadqaarkaaitetpdtstlli。

8、第二方面，本發(fā)明提供了一種核酸分子，所述核酸分子含有第一方面所述的逆轉錄酶突變體的編碼序列。

9、第三方面，本發(fā)明提供了一種重組載體，所述重組載體含有第二方面所述的核酸分子。

10、第四方面，本發(fā)明提供了一種重組細胞，所述重組細胞含有第二方面所述的核酸分子和/或第三方面所述的重組載體。

11、第五方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，所述試劑盒含有第一方面所述的鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重組載體或第四方面所述的重組細胞中的任意一種或至少兩種的組合。

12、第六方面，本發(fā)明提供了一種制備第一方面所述的逆轉錄酶突變體的方法，所述方法包括如下步驟：

13、(1)將逆轉錄酶的核酸序列seq?id?no.2插入表達載體中，得到野生型重組質粒mmlvwt，以所述重組質粒為模板，對所述逆轉錄酶的第524位點、第123位點、第259位點或第466位點中任意一種或至少兩種組合進行定點突變；

14、(2)將步驟(1)獲得的突變質粒轉化至宿主菌，進行培養(yǎng)及純化處理，得到所述逆轉錄酶突變體。

15、seq?id?no.2：

16、atgaccctaaatatagaagatgagcatcggctacatgagacctcaaaagagccagatgtttctctagggtccacatggctgtctgattttcctcaggcctgggcggaaaccgggggcatgggactggcagttcgccaagctcctctgatcatacctctgaaagcaacctctacccccgtgtccataaaacaataccccatgtcacaagaagccagactggggatcaagccccacatacagagactgttggaccagggaatactggtaccctgccagtccccctggaacacgcccctgctacccgttaagaaaccagggactaatgattataggcctgtccaggatctgagagaagtcaacaagcgggtggaagacatccaccccaccgtgcccaacccttacaacctcttgagcgggctcccaccgtcccaccagtggtacactgtgcttgatttaaaggatgcctttttctgcctgagactccaccccaccagtcagcctctcttcgcctttgagtggagagatccagagatgggaatctcaggacaattgacctggaccagactcccacagggtttcaaaaacagtcccaccctgtttgatgaggcactgcacagagacctagcagacttccggatccagcacccagacttgatcctgctacagtacgtggatgacttactgctggccgccacttctgagctagactgccaacaaggtactcgggccctgttacaaaccctagggaacctcgggtatcgggcctcggccaagaaagcccaaatttgccagaaacaggtcaagtatctggggtatcttctaaaagagggtcagagatggctgactgaggccagaaaagagactgtgatggggcagcctactccgaagacccctcgacaactaagggagttcctagggacggcaggcttctgtcgcctctggatccctgggtttgcagaaatggcagcccccttgtaccctctcaccaaaacggggactctgtttaattggggcccagaccaacaaaaggcctatcaagaaatcaagcaagctcttctaactgccccagccctggggttgccagatttgactaagccctttgaactctttgtcgacgagaagcagggctacgccaaaggtgtcctaacgcaaaaactgggaccttggcgtcggccggtggcctacctgtccaaaaagctagacccagtagcagctgggtggcccccttgcctacggatggtagcagccattgccgtactgacaaaggatgcaggcaagctaaccatgggacagccactagtcattctggccccccatgcagtagaggcactagtcaaacaaccccccgaccgctggctttccaacgcccggatgactcactatcaggccttgcttttggacacggaccgggtccagttcggaccggtggtagccctgaacccggctacgctgctcccactgcctgaggaagggctgcaacacaactgccttgatatcctggccgaagcccacggaacccgacccgacctaacggaccagccgctcccagacgccgaccacacctggtacacggatggaagcagtctcttacaagagggacagcgtaaggcgggagctgcggtgaccaccgagaccgaggtaatctgggctaaagccctgccagccgggacatccgctcagcgggctgaactgatagcactcacccaggccctaaagatggcagaaggtaagaagctaaatgtttatactgatagccgttatgcttttgctactgcccatatccatggagaaatatacagaaggcgtgggttgctcacatcagaaggcaaagagatcaaaaataaagacgagatcttggccctactaaaagccctctttctgcccaaaagacttagcataatccattgtccaggacatcaaaagggacacagcgccgaggctagaggcaaccggatggctgaccaagcggcccgaaaggcagccatcacagagactccagacacctctaccctcctcata。

17、優(yōu)選地，所述表達載體包括pet28a(+)。

18、優(yōu)選地，所述宿主菌包括大腸桿菌、畢氏酵母菌或枯草芽孢桿菌。

19、第七方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的逆轉錄酶突變體在逆轉錄反應中的應用。

20、優(yōu)選地，所述逆轉錄反應包括rt-pcr、rt-qpcr或rt-lamp中的任意一種。

21、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

22、本發(fā)明根據野生型mmlv逆轉錄酶已有的結構研究，通過其結構特征及關鍵氨基酸位點進行理性設計，通過定點突變篩選得到一系列更高效的逆轉錄酶，相較于野生型mmlv逆轉錄酶的15-30min，本發(fā)明逆轉錄酶突變體合成cdna時間僅為5min，進一步縮短了rt-qpcr的全流程時間，增加儀器的使用效率，促進一步法rt-qpcr產品的開發(fā)，在分子診斷領域具有廣泛的應用場景。