本發(fā)明涉及一種高效耐鎘促生菌群的篩選模型，具體涉及一種艾草根際高效耐鎘促生菌群的篩選復(fù)配模型及其應(yīng)用，屬于環(huán)境功能微生物分離培養(yǎng)。

背景技術(shù)：

1、艾草(artemisiaargyi)，菊科蒿屬多年生直立草本植物，以其濃郁的芳香而聞名，廣泛分布于中國(guó)、日本、朝鮮半島等東亞地區(qū)，常見(jiàn)于山坡、丘陵和部分荒地。艾草生長(zhǎng)迅速，生物量高，根系強(qiáng)健，對(duì)多種氣候和土壤條件都有良好的適應(yīng)性。其對(duì)鎘等多種重金屬具有較強(qiáng)的耐受性和一定的吸收能力，因此在重金屬污染土壤修復(fù)領(lǐng)域有較大的應(yīng)用潛力。同時(shí)，艾草作為一種芳香植物，艾草精油主要應(yīng)用于非食品領(lǐng)域，具有安全性、經(jīng)濟(jì)性和環(huán)保性。艾草精油的合成和提取不存在有害金屬積累，重金屬通過(guò)食物鏈傳播的風(fēng)險(xiǎn)較低。此外，艾草作為芳香植物的氣生部分具有避蟲(chóng)特性，適合大規(guī)模種植。因此將艾草用于重金屬污染土壤生態(tài)修復(fù)可以同時(shí)獲得較好的環(huán)境效益和經(jīng)濟(jì)效益。

2、艾草根際是艾草進(jìn)行新陳代謝的一個(gè)十分重要的區(qū)域，和土壤中的微生物可通過(guò)根際土壤進(jìn)行非常活躍的物質(zhì)交換。艾草根際微生物能直接或間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物抗逆能力。一直以來(lái)，植物根際促生細(xì)菌因其促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高作物產(chǎn)量、減輕重金屬毒性以及降低化肥成本等優(yōu)勢(shì)引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。其中根際細(xì)菌在根際豐度最高，可達(dá)106～108cfu/g。然而，在獲取艾草根際促生菌種資源時(shí)，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法耗時(shí)長(zhǎng)、菌群復(fù)雜，難以滿足艾草根際高效耐鎘促生菌群的分選與合成要求。因此，本專利公布了一種簡(jiǎn)單快捷的高效耐鎘促生菌群合成方法，首先判定具有分選潛力的艾草根系樣品，然后將其經(jīng)過(guò)極限稀釋法制備成懸濁液后，轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板上進(jìn)行大批量擴(kuò)培繁殖，結(jié)合功能預(yù)測(cè)、培養(yǎng)基優(yōu)化、功能驗(yàn)證、功能篩選等步驟，僅需15天即可獲得近百株具有耐鎘、促生功能的根系細(xì)菌。進(jìn)一步將其復(fù)配合成高效穩(wěn)定的多功能菌劑，可有效提高艾草在鎘污染脅迫下的生長(zhǎng)能力和修復(fù)效果，為鎘污染礦區(qū)土壤生態(tài)修復(fù)提供豐富的菌種資源與技術(shù)支撐。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有問(wèn)題存在的問(wèn)題，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種艾草根際高效耐鎘促生菌群的篩選復(fù)配模型。該模型首先判定具有分選潛力的艾草根系樣品，然后將其經(jīng)過(guò)極限稀釋法制備成懸濁液后，轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板上進(jìn)行大批量擴(kuò)培繁殖，結(jié)合功能預(yù)測(cè)、培養(yǎng)基優(yōu)化、功能驗(yàn)證、功能篩選等步驟，僅需15天即可獲得近百株具有耐鎘、促生功能的根系細(xì)菌。進(jìn)一步將其復(fù)配合成高效穩(wěn)定的多功能菌劑，可有效提高艾草在鎘污染脅迫下的生長(zhǎng)能力和修復(fù)效果，為鎘污染礦區(qū)土壤生態(tài)修復(fù)提供豐富的菌種資源與技術(shù)支撐。

2、本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種艾草根際高效耐鎘促生菌群的篩選復(fù)配模型的應(yīng)用，篩選艾草根際耐鎘促生細(xì)菌用以制備復(fù)合菌劑、或含有所述菌劑的微生態(tài)制劑、或含有所述菌劑或所述微生態(tài)制劑的生物肥料。

3、為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供了一種艾草根際高效耐鎘促生菌群的篩選復(fù)配模型，包括：

4、步驟s1、采集鎘染污場(chǎng)地艾草根系樣品進(jìn)行基因測(cè)序及功能基因分析，構(gòu)建樣品功能基因數(shù)據(jù)庫(kù)；

5、步驟s2、以耐鎘基因集為訓(xùn)練目標(biāo)，通過(guò)隨機(jī)森林模型對(duì)步驟s1所得數(shù)據(jù)集進(jìn)行分類粗選，獲取粗選樣品；

6、步驟s3、將粗選樣品稀釋后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板培養(yǎng)，提取培養(yǎng)板中各渾濁孔的細(xì)菌基因組，并進(jìn)行基因測(cè)序及功能基因分析，進(jìn)行分類精選，獲取精選樣品；

7、步驟s4、對(duì)精選樣品中的單菌和混菌分別進(jìn)行植物促生功能鑒定和分離純化，并將單菌和/或混菌分離純化后所得的單菌進(jìn)行復(fù)配，檢測(cè)各菌株之間的共存模式，篩選出最優(yōu)復(fù)配菌群，然后進(jìn)行艾草促生實(shí)驗(yàn)。

8、作為一項(xiàng)優(yōu)選的方案，所述樣品功能基因數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程為：從鎘污染場(chǎng)地采集的艾草根系樣品中提取根際細(xì)菌的基因組dna作為模板，以799f正向引物，以1193r為反向引物對(duì)內(nèi)生菌特異性最佳的v5～v7區(qū)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，收集所有擴(kuò)增后的產(chǎn)物，即得。

9、作為一項(xiàng)優(yōu)選的方案，所述799f正向引物為5’-barcode+aacmggattagataccckg-3’。

10、作為一項(xiàng)優(yōu)選的方案，所述1193r反向引物為5’-acgtcatccccaccttcc-3’。

11、作為一項(xiàng)優(yōu)選的方案，所述耐鎘基因集包括czcd、zipb、cmtr、cadc和ipdc。

12、作為一項(xiàng)優(yōu)選的方案，所述隨機(jī)森林模型中，決策樹(shù)數(shù)量為300～800，每次決策時(shí)，從所有輸入特征中隨機(jī)選擇30～40％的特征用于節(jié)點(diǎn)分裂；所述隨機(jī)森林模型還需進(jìn)行優(yōu)化，模型的優(yōu)化采用10折重復(fù)交叉驗(yàn)證。

13、本發(fā)明采用500棵決策樹(shù)進(jìn)行模型構(gòu)建，每棵決策樹(shù)在構(gòu)建過(guò)程中，通過(guò)隨機(jī)抽樣的方式選取三分之一的特征變量用于節(jié)點(diǎn)分裂，以提高模型的泛化能力。該模型的訓(xùn)練集與測(cè)試集按照75％與25％的比例劃分，其中mtry作為關(guān)鍵參數(shù)被調(diào)整以獲得最優(yōu)的模型性能。此外，使用boruta算法對(duì)輸入變量進(jìn)行重要性排序，以篩選出對(duì)模型預(yù)測(cè)結(jié)果影響最大的特征變量，并以這些變量作為輸入變量構(gòu)建最終的隨機(jī)森林模型。

14、作為一項(xiàng)優(yōu)選的方案，所述粗選樣品稀釋的方式為極限稀釋法，將粗選樣品制備成濃度為1×106～1×108cfu/ml的懸濁液。

15、作為一項(xiàng)優(yōu)選的方案，所述培養(yǎng)板中液體培養(yǎng)基中cd2+的濃度為0.2～2mmol/l，胰酪大豆胨的濃度為10～50％。

16、作為一項(xiàng)優(yōu)選的方案，所述分類精選得過(guò)程包括：

17、步驟s3-1、采用無(wú)菌封口膜密封培養(yǎng)板，于室溫條件下培養(yǎng)至渾濁孔不再增加時(shí)，保留出現(xiàn)30％渾濁孔的培養(yǎng)板；

18、步驟s3-2、采用picrust2算法和kegg數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)渾濁孔菌種測(cè)序注釋所得的asv進(jìn)行功能基因預(yù)測(cè)，確定含有鎘耐受和促生潛力，且純度為1～5個(gè)屬(genus)的根際細(xì)菌菌孔作為精選樣品予以保留。

19、作為一項(xiàng)優(yōu)選的方案，所述精選樣品中的單菌直接進(jìn)行植物促生功能鑒定。

20、作為一項(xiàng)優(yōu)選的方案，所述精選樣品中的混菌則是先通過(guò)komodo中傳遞預(yù)測(cè)模式協(xié)同過(guò)濾預(yù)測(cè)獲取混菌各自的最佳培養(yǎng)基配方，再分離純化得到單菌再進(jìn)行植物促生功能鑒定。

21、作為一項(xiàng)優(yōu)選的方案，所述混菌最佳培養(yǎng)基配方的過(guò)程為：通過(guò)komodo結(jié)合ncbi微生物分類和微生物培養(yǎng)基數(shù)據(jù)庫(kù)dsmz，依據(jù)傳遞預(yù)測(cè)模式和協(xié)同過(guò)濾預(yù)測(cè)，根據(jù)16srrna的系統(tǒng)進(jìn)化相似性和已知培養(yǎng)基的物種來(lái)推斷其相似性高的近緣物種的培養(yǎng)基用于純化渾濁混菌菌孔。

22、作為一項(xiàng)優(yōu)選的方案，所述植物促生功能鑒定的過(guò)程為：

23、步驟s4-1、將單菌或混菌分離純化后所得單菌分別接種于ashby's培養(yǎng)基、pvk培養(yǎng)基和cas培養(yǎng)基，于30～40℃下培養(yǎng)1～3天，觀察菌落周?chē)乃馊?，以判斷該菌株是否具有固氮、溶磷和產(chǎn)鐵載體的特性；

24、步驟s4-2、將單菌或混菌分離純化后所得單菌接種于含有0.1～1g/l色氨酸的lb液體培養(yǎng)基中，在30～40℃恒溫條件下的搖床中震蕩培養(yǎng)3～5天，加入比色液判斷該菌株是否具有產(chǎn)iaa特性。

25、作為一項(xiàng)優(yōu)選的方案，所述最優(yōu)復(fù)配菌群的篩選過(guò)程為：將單菌或混菌分離純化后所得單菌兩兩組合，共培養(yǎng)在相同的培養(yǎng)基中，分析每對(duì)菌株之間的相互作用類型，選擇促生效果最佳的菌株組合，然后在最佳的菌株組合下確定最終最佳復(fù)配比例。

26、作為一項(xiàng)優(yōu)選的方案，所述艾草促生實(shí)驗(yàn)的過(guò)程為：將最優(yōu)復(fù)配菌群接種于lb液體培養(yǎng)基中，于30～40℃、150～200r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)1～2天，直至菌懸液濃度達(dá)到1×106～1×108cfu/ml，離心并去除上清液后接種至盆栽中驗(yàn)證其對(duì)鎘脅迫下艾草的促生效果。

27、本發(fā)明還提供了一種艾草根際高效耐鎘促生菌群的篩選復(fù)配模型的應(yīng)用，篩選艾草根際耐鎘促生細(xì)菌用以制備復(fù)合菌劑、或含有所述菌劑的微生態(tài)制劑、或含有所述菌劑或所述微生態(tài)制劑的生物肥料。

28、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明技術(shù)方案的有益技術(shù)效果為：

29、本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單快捷的高效耐鎘促生菌群篩選復(fù)配模型。該模型首先判定具有分選潛力的艾草根系樣品，然后將其經(jīng)過(guò)極限稀釋法制備成懸濁液后，轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板上進(jìn)行大批量擴(kuò)培繁殖，結(jié)合功能預(yù)測(cè)、培養(yǎng)基優(yōu)化、功能驗(yàn)證、功能篩選等步驟，僅需15天即可獲得近百株具有耐鎘、促生功能的根系細(xì)菌。進(jìn)一步將其復(fù)配合成高效穩(wěn)定的多功能菌劑，可有效提高艾草在鎘污染脅迫下的生長(zhǎng)能力和修復(fù)效果，為鎘污染礦區(qū)土壤生態(tài)修復(fù)提供豐富的菌種資源與技術(shù)支撐。