本發(fā)明涉及一種嵌合啟動(dòng)子及其用途，特別是涉及一種由三個(gè)彼此異源的dna分子嵌合構(gòu)成的新型組成型啟動(dòng)子及其用途。

背景技術(shù)：

1、植物的地下根系部分對(duì)植物的代謝及吸收起著不可或缺的作用，可對(duì)來(lái)自土壤中的水分、無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行吸收利用，為植物的生長(zhǎng)發(fā)育和結(jié)實(shí)提供支持。植物籽粒是決定產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一。但自然環(huán)境中的一些生物和非生物脅迫對(duì)植物根部和籽粒的生長(zhǎng)產(chǎn)生了較大的威脅，如土傳病害、地下害蟲(chóng)和刺吸性害蟲(chóng)，其嚴(yán)重影響了一些重要糧食和經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量。因此，植物根部和籽粒是育種遺傳改良的重要目標(biāo)。

2、為抵御植物的生物和非生物脅迫威脅，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用顯得尤為重要。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可將外源dna序列連接到特定的啟動(dòng)子從而啟動(dòng)外源dna序列在植物宿主中表達(dá)，啟動(dòng)子類(lèi)型的選擇決定基因的表達(dá)時(shí)間和部位。例如，組成型啟動(dòng)子可對(duì)整個(gè)植物組織進(jìn)行組成型表達(dá)，組織特異性啟動(dòng)子僅在植物特定組織中表達(dá)基因，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可在某些物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下提高基因表達(dá)水平。目前農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用較多的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子以及對(duì)現(xiàn)有組成型啟動(dòng)子進(jìn)行修飾后得到的嵌合啟動(dòng)子，然而在利用嵌合啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)化作物以期改良作物的品質(zhì)時(shí)，往往會(huì)由于目的基因在植物某些重要細(xì)胞類(lèi)型(例如植物根部和籽粒)中表達(dá)量不足而導(dǎo)致改良效果不明顯。

3、鑒于此，本發(fā)明提供了新型嵌合啟動(dòng)子，所述嵌合啟動(dòng)子可在植物中啟動(dòng)目的基因組成型表達(dá)且在植物根部和籽粒中表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種新穎的嵌合啟動(dòng)子及其用途，所述嵌合啟動(dòng)子可在植物中啟動(dòng)目的基因組成型表達(dá)且在植物根部和籽粒中表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種嵌合啟動(dòng)子，所述嵌合啟動(dòng)子的核苷酸序列包括：(1)與seq?id?no:1所示的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列；或(2)具有seq?id?no:1所示的核苷酸序列。

3、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)盒，其包含與目的異源核苷酸序列有效連接的所述嵌合啟動(dòng)子。

4、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種dna構(gòu)建體，其包含所述表達(dá)盒。

5、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種或重組載體，其包含所述dna構(gòu)建體。

6、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種在植物中表達(dá)目的異源核苷酸序列的方法，包括：將所述表達(dá)盒或所述dna構(gòu)建體穩(wěn)定的整合進(jìn)植物細(xì)胞中，使得所述目的異源核苷酸序列在所述植物中表達(dá)。

7、優(yōu)選地，所述目的異源核苷酸序列編碼非生物應(yīng)激抗性蛋白質(zhì)或生物應(yīng)激抗性蛋白質(zhì)。

8、進(jìn)一步地，所述非生物應(yīng)激抗性蛋白質(zhì)為除草劑耐受性蛋白質(zhì)。所述生物應(yīng)激抗性蛋白質(zhì)為昆蟲(chóng)抗性蛋白質(zhì)。

9、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種所述嵌合啟動(dòng)子用于在植物組織中組成型表達(dá)目的異源核苷酸序列的用途。

10、進(jìn)一步地，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。

11、在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述雙子葉植物包括但不限于苜蓿、菜豆、花椰菜、甘藍(lán)、胡蘿卜、芹菜、棉花、黃瓜、茄子、萵苣、甜瓜、豌豆、胡椒、西葫蘆、蘿卜、油菜、菠菜、大豆、南瓜、番茄、擬南芥、花生或西瓜；優(yōu)選地，所述雙子葉植物是指黃瓜、大豆、擬南芥、煙草、棉花、花生或油菜。所述單子葉植物包括但不限于玉米、水稻、高粱、小麥、大麥、黑麥、粟、甘蔗、燕麥或草坪草；優(yōu)選地，所述單子葉植物是指玉米、水稻、高粱、小麥、大麥、粟、甘蔗或燕麥。

12、提供以下描述和定義是為了更好地限定本發(fā)明以及指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明。除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)應(yīng)根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的常規(guī)用法來(lái)理解。

13、本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“核酸(序列)”或“dna分子”是指基因組或合成來(lái)源的雙鏈dna分子，即從5’(上游)末端讀取到3’(下游)末端的脫氧核苷酸堿基的聚合物或dna分子。術(shù)語(yǔ)“dna序列”是指dna分子的核苷酸序列。

14、本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”通常是指參與識(shí)別和結(jié)合rna聚合酶ii和其他蛋白質(zhì)(諸如反式作用轉(zhuǎn)錄因子)以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的dna分子。啟動(dòng)子可最初從基因的基因組拷貝的5’非翻譯區(qū)(5′utr)中分離?？商娲?，啟動(dòng)子可以是合成產(chǎn)生的或操縱的dna分子。啟動(dòng)子可以是嵌合的。

15、本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“嵌合”是指通過(guò)將第一dna分子融合至第二dna分子而產(chǎn)生的單個(gè)dna分子，其中無(wú)論所述第一dna分子還是所述第二dna分子通常都不會(huì)以所述構(gòu)型存在，即彼此融合。因此，嵌合dna分子是通常不以其他方式存在于自然界中的新的dna分子。術(shù)語(yǔ)“嵌合啟動(dòng)子”是指通過(guò)兩個(gè)或更多個(gè)異源dna分子的融合產(chǎn)生的新的啟動(dòng)子，例如通過(guò)在具有其自身部分或完全調(diào)節(jié)序列的活性啟動(dòng)子上添加異源調(diào)節(jié)序列，也可以通過(guò)在無(wú)活性的截短啟動(dòng)子的5’上游區(qū)添加異源調(diào)節(jié)序列，發(fā)展出嵌合啟動(dòng)子，所述無(wú)活性的截短啟動(dòng)子即僅包括核心tata并任選包括ccaat元件的啟動(dòng)子。

16、本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“組成型啟動(dòng)子”是指在該類(lèi)啟動(dòng)子的控制下，目的異源核苷酸序列的表達(dá)大體恒定在一定水平上，在植物的不同組織和/或不同生長(zhǎng)發(fā)育階段表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。所述組織為植物體中由來(lái)源相同和執(zhí)行同一功能的一種或多種類(lèi)型細(xì)胞集合而成的結(jié)構(gòu)單位，例如保護(hù)組織、輸導(dǎo)組織、營(yíng)養(yǎng)組織、機(jī)械組織、分生組織，幾種不同的組織有機(jī)配合、緊密聯(lián)系，形成不同的器官，不同的器官之間互相配合，更有效地完成有機(jī)體的整個(gè)生命活動(dòng)過(guò)程。所述生長(zhǎng)發(fā)育階段可根據(jù)植物形態(tài)、機(jī)能的差異劃分為胚胎階段、幼苗階段、成熟階段和衰老階段。本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“組成型表達(dá)”是指目的異源核苷酸序列在植物的不同組織和/或不同生長(zhǎng)發(fā)育階段都以大體上一致的水平進(jìn)行表達(dá)。

17、本發(fā)明中，“序列同一性”指兩個(gè)最佳比對(duì)的dna或氨基酸序列在組分(例如核苷酸或氨基酸)的比對(duì)窗口整個(gè)范圍內(nèi)不變的程度。測(cè)試序列和參考序列(本發(fā)明seq?id?no:1)的已比對(duì)區(qū)段的“同一性分?jǐn)?shù)”是由兩個(gè)比對(duì)序列所共有的相同組分的數(shù)目除以參考序列區(qū)段(即完整的參考序列或參考序列的更小限定的部分)中組分的總數(shù)目。“同一性％”是同一性分?jǐn)?shù)乘以100。例如可從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(national?center?forbiotechnology?information；www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得的blast運(yùn)算法則，使用默認(rèn)參數(shù)確定。

18、本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“有效連接”表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對(duì)相連序列來(lái)說(shuō)需要的功能。本發(fā)明中所述“有效連接”可以為將本發(fā)明所述嵌合啟動(dòng)子與感興趣的目的異源核苷酸序列相連，使得該感興趣的目的異源核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該嵌合啟動(dòng)子控制和調(diào)控。可以“有效連接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表達(dá)功能的序列(即基因表達(dá)元件，例如啟動(dòng)子、5’非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點(diǎn)和/或轉(zhuǎn)錄終止子)、提供dna轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列(即t-dna邊界序列、位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別位點(diǎn)、整合酶識(shí)別位點(diǎn))、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標(biāo)記物、生物合成基因)、提供可計(jì)分標(biāo)記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列(即多接頭序列、位點(diǎn)特異性重組序列)和提供復(fù)制功能的序列(即細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)、自主復(fù)制序列、著絲粒序列)。

19、本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“重組”是指由基因工程引起并且通常不存在于自然界中的非天然發(fā)生的dna、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、種子或生物體?！爸亟Mdna分子”是指包含在自然界中非天然地發(fā)生并且由人類(lèi)干預(yù)產(chǎn)生的dna分子，如由彼此異源的至少兩個(gè)dna分子構(gòu)成的dna分子。其中，“基因工程”是指創(chuàng)造通常不存在于自然界中并且需要施加人類(lèi)干預(yù)的非天然dna、蛋白質(zhì)或生物體?；蚬こ炭捎糜谑褂蒙锛夹g(shù)，如分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)生物化學(xué)、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、以及植物轉(zhuǎn)化中的一種或多種技術(shù)以構(gòu)思并創(chuàng)造的工程dna、蛋白質(zhì)或生物體。

20、“除草劑耐受性”或“耐受性”是指完全或部分不受一種或多種除草劑的存在或施用影響的能力，例如當(dāng)施用時(shí)抵抗除草劑的毒性作用的能力。如果細(xì)胞、種子或植物在一種或多種除草劑的存在下能夠維持至少一些正常的生長(zhǎng)或表型，則所述細(xì)胞、種子或植物是“除草劑耐受的”或具有“改善的耐受性”。如果與野生型或?qū)φ占?xì)胞、植物或種子相比，性狀的存在可以賦予細(xì)胞、植物或種子對(duì)除草劑的改善的耐受性，則所述性狀是除草劑耐受性性狀。包含除草劑耐受性性狀的作物可以繼續(xù)生長(zhǎng)，并且受除草劑的存在的影響最小。如果與野生型或?qū)φ占?xì)胞、植物或種子相比，蛋白質(zhì)的表達(dá)可以賦予細(xì)胞、植物或種子對(duì)除草劑的改善的耐受性，則所述蛋白質(zhì)賦予了“除草劑耐受性”。“除草劑耐受性蛋白質(zhì)”包括但不限于乙酰乳酸合酶、芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶、5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶、羥基苯丙酮酸雙加氧酶、草胺磷乙酰轉(zhuǎn)移酶、原卟啉原氧化酶、草甘膦氧化還原酶。除草劑耐受性可以是對(duì)特定除草劑的完全或部分不敏感性，并且可以表示為對(duì)特定除草劑的耐受性或不敏感性百分比(％)。

21、“昆蟲(chóng)抗性蛋白質(zhì)”可以抑制(抑制生長(zhǎng)、攝食、繁殖力或存活力)、遏制(遏制生長(zhǎng)、攝食、繁殖力或存活力)、控制(控制害蟲(chóng)侵?jǐn)_、控制含有有效劑量的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)在特定作物上的害蟲(chóng)攝食活動(dòng))或殺死(引起發(fā)病、死亡或降低繁殖力)害蟲(chóng)。對(duì)害蟲(chóng)提供有效劑量的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)，使所述害蟲(chóng)暴露于所述殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)以導(dǎo)致發(fā)病、死亡、繁殖力降低或發(fā)育遲緩?！袄ハx(chóng)抗性蛋白質(zhì)”還包括由于在植物中或在植物上提供有效劑量的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)而將害蟲(chóng)從植物、植物組織、植物部分、種子、植物細(xì)胞或從植物可能生長(zhǎng)的特定地理位置中驅(qū)離。殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)可由植物產(chǎn)生，或可被施加于植物或植物所位于的位置內(nèi)的環(huán)境。

22、術(shù)語(yǔ)“基因”是指在適宜的調(diào)控區(qū)域(例如植物可表達(dá)性啟動(dòng)子區(qū)域)控制下在細(xì)胞內(nèi)含有被轉(zhuǎn)錄成rna分子(例如mrna)的dna區(qū)域(“轉(zhuǎn)錄的dna區(qū)域”)的任何dna片段。因此，基因可能含有幾種有效連接的dna片段，例如啟動(dòng)子、5’非翻譯前導(dǎo)序列、編碼區(qū)域和含有多聚腺苷酸化位點(diǎn)的3’非翻譯區(qū)域。內(nèi)源植物基因是在植物物種中天然發(fā)現(xiàn)的基因。嵌合基因是通常不在植物物種中發(fā)現(xiàn)的任何基因，或者是在天然情況下其啟動(dòng)子與部分或全部轉(zhuǎn)錄的dna區(qū)域或者與該基因的至少另一調(diào)控區(qū)域無(wú)關(guān)的任何基因。

23、術(shù)語(yǔ)“天然”指天然出現(xiàn)的(“野生型”)核酸序列。

24、術(shù)語(yǔ)“異源”序列指源自外來(lái)來(lái)源或物種的序列，或者當(dāng)來(lái)自同一來(lái)源時(shí)指由其原始形式受到修飾的序列。

25、本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“dna構(gòu)建體”是包含兩個(gè)或更多個(gè)異源的dna序列的重組dna分子。dna構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)并且可包含在載體和質(zhì)粒中。dna構(gòu)建體可用于載體中以用于轉(zhuǎn)化的目的，即將異源dna引入到宿主細(xì)胞中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和植物，并且還可包含在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、植物或其部分、種子的質(zhì)粒dna或基因組dna中?！爸参镛D(zhuǎn)化載體”典型地含有包含t-dna轉(zhuǎn)移(如左邊界和右邊界)所需的順式作用序列的質(zhì)粒載體、經(jīng)工程改造成能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)的選擇性標(biāo)記、和目的基因，此質(zhì)粒載體上也存在細(xì)菌復(fù)制所需的序列，將順式作用序列以允許有效轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中并在其中表達(dá)的方式進(jìn)行排列。例如，所述選擇性標(biāo)記基因和殺有害生物基因位于左邊界和右邊界之間。如本領(lǐng)域所理解的，所述“植物轉(zhuǎn)化載體”含有允許通過(guò)農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞、以及通過(guò)在邊界序列切割進(jìn)行dna的轉(zhuǎn)移和vir介導(dǎo)的dna轉(zhuǎn)移的毒力功能(vir基因)(hellens和mullineaux,trends?in?plantscience,(2000)5：446-451)。

26、用于轉(zhuǎn)化宿主植物細(xì)胞的適合方法包括可將dna引入到細(xì)胞中(例如將重組dna構(gòu)建體穩(wěn)定地整合到植物染色體中)的任何方法是本領(lǐng)域熟知的。用于將重組dna構(gòu)建體引入到植物中的示例性的且廣泛利用的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的土壤桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。用于將重組dna構(gòu)建體引入到植物中的另一種示例性方法是通過(guò)定點(diǎn)整合的方法將重組dna構(gòu)建體插入到預(yù)先確定的位點(diǎn)處的植物基因組中。定點(diǎn)整合可通過(guò)本領(lǐng)域已知的的任何方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)使用鋅指核酸酶、工程化或天然大范圍核酸酶、tale內(nèi)切核酸酶、或rna指導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶(如crispr/cas9系統(tǒng))來(lái)實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因植物可通過(guò)植物細(xì)胞培養(yǎng)方法從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生。用于再生植物的方法在本領(lǐng)域也是熟知的。例如，已經(jīng)利用ti質(zhì)粒載體用于傳送外源dna，以及直接dna攝入、脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射以及微彈。

27、本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“植物部分”或“植物組織”包括植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、植物可以由之再生的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物簇以及在植物或以下植物的部分中完整的植物細(xì)胞，這些植物的部分是如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實(shí)、核、穗、穗軸、外殼、莖、根、根尖、花藥等。

28、本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細(xì)胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細(xì)胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細(xì)胞核和質(zhì)體和線(xiàn)粒體基因組。

29、術(shù)語(yǔ)“蛋白”、“蛋白質(zhì)”在本發(fā)明中可互換地使用，指的是氨基酸殘基的聚合物。所述氨基酸殘基的聚合物中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是一個(gè)相應(yīng)的天然存在的氨基酸的一種人工化學(xué)類(lèi)似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以重組產(chǎn)生，也可以通過(guò)化學(xué)合成。

30、本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”是指由于人類(lèi)干預(yù)(例如植物轉(zhuǎn)化方法)合并入生物體基因組中的dna分子。

31、本發(fā)明中使用的冠詞“一個(gè)”和“一種”是指一個(gè)(種)或多于一個(gè)(種)(即至少一個(gè))。例如，“一種要素”表示一種或多種要素(元件)。

32、本發(fā)明提供了一種嵌合啟動(dòng)子及其用途，具有與對(duì)照啟動(dòng)子相比顯著提高的調(diào)節(jié)活性。

33、下面通過(guò)實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。