本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一個(gè)不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因及其應(yīng)用，具體涉及從不結(jié)球白菜中克隆得到一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因，在不結(jié)球白菜中沉默該基因，獲得的沉默植株開(kāi)花時(shí)間顯著推遲。

背景技術(shù)：

1、開(kāi)花是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中一個(gè)重要的過(guò)渡階段，對(duì)繁育后代至關(guān)重要。開(kāi)花就是對(duì)莖尖分生組織sam中經(jīng)過(guò)整合的各種內(nèi)部和外界信號(hào)的一種響應(yīng)，比如，擬南芥ft蛋白在葉片中表達(dá)并被轉(zhuǎn)運(yùn)至sam從而誘導(dǎo)開(kāi)花。一系列調(diào)控開(kāi)花時(shí)間的基因相互作用形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。年齡途徑調(diào)控的開(kāi)花主要是由mir156及其靶基因spl轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控的。spl屬于植物特異性轉(zhuǎn)錄因子sbp家族，具有高保守的sbp-box結(jié)構(gòu)域，由大約80個(gè)氨基酸殘基、2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和1個(gè)核定位的信號(hào)組成。在金魚草中首次發(fā)現(xiàn)的spl家族成員是與ap1基因同源的sbp1和sbp2，可以結(jié)合mads-box基因的啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控開(kāi)花。spl家族基因廣泛分布于裸子植物和被子植物中。spl在調(diào)節(jié)植物開(kāi)花和響應(yīng)環(huán)境脅迫等方面都發(fā)揮著作用。擬南芥中有spl2、spl9、spl10、spl11、spl13和spl15可以直接調(diào)控ap1、lfy、ful和soc1來(lái)調(diào)控開(kāi)花。

2、不結(jié)球白菜屬于十字花科蕓薹屬，是一種起源于中國(guó)的重要經(jīng)濟(jì)作物。由于不結(jié)球白菜口味清甜、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，目前已經(jīng)逐漸成為最受歡迎的蔬菜之一。擬南芥中spl15基因功能已有研究，但不結(jié)球白菜中spl15基因的作用還不清楚。因此，對(duì)不結(jié)球白菜中spl15基因的功能研究，特別是在不結(jié)球白菜花期調(diào)控方面，需要進(jìn)一步的探索和挖掘。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的是提供不結(jié)球白菜(brassica?campestris?ssp.chinensis?makino)轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、第一方面，本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)一種不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

4、第二方面，本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)上述不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

5、第三方面，本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)用于擴(kuò)增前述不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因cdna的引物對(duì)，該引物對(duì)的正向引物序列如seq?id?no.3所示，反向引物序列如seq?id?no.4所示。

6、第四方面，本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)與上述不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因相關(guān)的生物材料，該生物材料為如下(a1)或(a2)所述的生物材料：

7、(a1)含有權(quán)利要求1所述不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因的表達(dá)盒、重組載體或重組菌；

8、(a2)用于沉默、干擾或抑制所述不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因的生物材料。

9、進(jìn)一步，(a2)中所述用于沉默、干擾或抑制所述不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因的生物材料為如下(b1)～(b4)中的至少一種：

10、(b1)所述不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因的干擾片段或沉默片段；

11、(b2)用于擴(kuò)增(b1)所述不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因干擾片段或沉默片段的引物；

12、(b3)所述不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因的干擾表達(dá)載體或沉默載體；

13、(b4)含有如(b3)所述干擾表達(dá)載體或沉默載體的重組微生物。

14、更進(jìn)一步，(b1)中所述不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因的沉默片段為特異的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。

15、第五方面，本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)上述的不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因，上述的蛋白、上述的引物對(duì)或上述的生物材料在如下(c1)或(c2)中的應(yīng)用：

16、(c1)調(diào)控植物開(kāi)花時(shí)間；

17、(c2)培育開(kāi)花時(shí)間改變的植物新種質(zhì)。

18、上述的應(yīng)用具體為推遲植物開(kāi)花時(shí)間或培育開(kāi)花時(shí)間推遲的植物新種質(zhì)；或者促進(jìn)植物開(kāi)花時(shí)間的提前或培育開(kāi)花時(shí)間提前的植物新種質(zhì)。

19、進(jìn)一步，通過(guò)在目標(biāo)植物中沉默或抑制所述轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因的表達(dá)或降低所述轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因編碼蛋白的水平推遲植物的開(kāi)花時(shí)間或培育開(kāi)花時(shí)間推遲的植物新種質(zhì)；或者通過(guò)在目標(biāo)植物中上調(diào)所述轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因的表達(dá)或上調(diào)所述轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因編碼蛋白的水平促進(jìn)植物開(kāi)花時(shí)間的提前或培育開(kāi)花時(shí)間提前的植物新種質(zhì)。

20、第六方面，本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)一種調(diào)控植物開(kāi)花時(shí)間或培育開(kāi)花時(shí)間改變的植物新種質(zhì)的方法，通過(guò)在目標(biāo)植物中沉默或抑制所述轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因的表達(dá)或降低所述轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因編碼蛋白的水平推遲植物的開(kāi)花時(shí)間，或篩選培育開(kāi)花時(shí)間推遲的植物新種質(zhì)；或者通過(guò)在目標(biāo)植物中上調(diào)所述轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因的表達(dá)或上調(diào)所述轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因編碼蛋白的水平促進(jìn)植物開(kāi)花時(shí)間的提前或培育開(kāi)花時(shí)間提前的植物新種質(zhì)。

21、本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，上述應(yīng)用或方法中的植物為不結(jié)球白菜或煙草。

22、本發(fā)明首次從不結(jié)球白菜中克隆到一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因，該基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；編碼的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

23、克隆bcspl15基因cdna序列的引物對(duì)，其核苷酸序列如下所示：

24、正向引物：5’-atggagttactaacgggttctggtc-3’(seq?id?no：3)；

25、反向引物：5’-aagagaccagttgaaatgctgagg-3’(seq?id?no：4)。

26、用于沉默本發(fā)明所述bcspl15基因的vigs沉默載體。

27、不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因特異的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。bcspl15基因的發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列如下所示：

28、5’-atagggtaacaatggctcagacaccacccgtttcagtccatggactgaaacgggtggtgtctgagccattgttaccctat-3’(seq?id?no：5)。

29、本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因在推遲不結(jié)球白菜開(kāi)花時(shí)間中的應(yīng)用，具體包括以下步驟：

30、1)構(gòu)建所述不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因的沉默載體；

31、2)將所構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化到不結(jié)球白菜細(xì)胞中；

32、3)篩選培育得到開(kāi)花時(shí)間推遲的不結(jié)球白菜新品種。

33、相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為：

34、本發(fā)明以不結(jié)球白菜‘五月慢’為材料，首次揭示不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因的生物學(xué)功能，通過(guò)構(gòu)建bcspl15的vigs沉默載體，結(jié)合基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法，研究沉默bcspl15對(duì)不結(jié)球白菜開(kāi)花時(shí)間的影響。試驗(yàn)表明不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子bcspl15基因在植物基因工程中可應(yīng)用于調(diào)控開(kāi)花時(shí)間，為不結(jié)球白菜開(kāi)花調(diào)控的研究提供有價(jià)值的候選基因。