本發(fā)明屬于生物發(fā)酵，具體地，涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)l-組氨酸的方法。

背景技術(shù)：

1、組氨酸（l-histidine）化學(xué)名α-氨基β-咪唑基丙酸，是分子中含有咪唑核的堿性氨基酸。l-組氨酸是人體的一種半必需氨基酸,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料行業(yè),還用于煙草制品和化妝品的生產(chǎn)中。l-組氨酸的生產(chǎn)以蛋白質(zhì)水解法為主,但此法存在操作步驟繁瑣、環(huán)境污染大、生產(chǎn)成本高等問題。近年來，微生物發(fā)酵法已成功應(yīng)用于多種氨基酸的工業(yè)生產(chǎn)中,具有發(fā)酵周期短、成本低、作用條件溫和、過程易控制和產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn),也是工業(yè)化生產(chǎn)l-組氨酸的首選方法。采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)l-組氨酸具有廣闊的前景，而且其產(chǎn)率還有很大的提高空間。

2、現(xiàn)有技術(shù)對(duì)組氨酸生物發(fā)酵研究主要包括：篩選菌株、優(yōu)化培養(yǎng)工藝以及添加刺激因子等因素。

3、文獻(xiàn)1：生物技術(shù)2008年，趙建云等，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加葡萄糖酸鈣能夠增加hmp途徑的通量，有利于谷氨酸棒桿菌clw0911中組氨酸的合成。

4、文獻(xiàn)2：微生物技術(shù)通訊2009年，朱文澤等，提供了一種提高l-組氨酸發(fā)酵過程產(chǎn)率的方法，根據(jù)調(diào)整細(xì)胞代謝流分配的原理，采用在培養(yǎng)基中添加檸檬酸或其鹽的方法，來有效提高谷氨酸棒桿菌tl1105中l(wèi)-組氨酸發(fā)酵的產(chǎn)率。

5、文獻(xiàn)3：cn112481325a，不同菌株的產(chǎn)酸機(jī)制以及對(duì)刺激因子的耐受程度差異較大，但是并不具備借鑒意義，盡管現(xiàn)有技術(shù)對(duì)谷氨酸的產(chǎn)酸機(jī)制作了較多研究，例如在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的蘋果酸鈉能夠提高谷氨酸棒桿菌產(chǎn)組氨酸的量，但是蘋果酸鈉對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌atcc31026并無明顯刺激效果；而通過流加乙酸鈣和丙二酸對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)組氨酸的能力明顯提高。

6、原核生物細(xì)胞能量和物質(zhì)代謝的途徑是一個(gè)很復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò),?改變代謝途徑中的基因會(huì)對(duì)能量和物質(zhì)流產(chǎn)生怎樣的影響,?仍然不是很清楚。由于不同的菌株的代謝通路也存在較大差異，針對(duì)不同的發(fā)酵菌株，需要通過實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行測(cè)試，如何提高特定菌株的發(fā)酵性能是需要解決的技術(shù)問題。

7、針對(duì)上述問題，申請(qǐng)人之前的專利技術(shù)“cn2024111171676”提供了一種利用生物發(fā)酵生產(chǎn)l-組氨酸的工藝，通過調(diào)節(jié)代謝網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控l-組氨酸的合成。本發(fā)明在上述研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分離提取，并優(yōu)化其工藝。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在已有研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)l-組氨酸的方法，該工藝發(fā)酵效率高，分離純化工藝簡單可行，制備的產(chǎn)品收率和純度均有所提高。

2、包括組氨酸、色氨酸、纈氨酸以及苯丙氨酸在內(nèi)的芳香族或雜環(huán)族氨基酸均與hmp途徑相關(guān)，途徑中的赤蘚糖-4-磷酸是合成芳香族、雜環(huán)族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和組氨酸）的關(guān)鍵原料。大腸埃希氏菌（escherichia?coli）tr2023d-1的產(chǎn)色氨酸能力較出發(fā)菌株大幅增加，說明hmp途徑的代謝流增加，與hmp途徑相關(guān)的其他氨基酸（包括組氨酸）的合成能力也極有可能上調(diào)，而該菌株屬于苯丙氨酸、酪氨酸缺陷型菌株，無需對(duì)苯丙氨酸和酪氨酸的合成進(jìn)行調(diào)控。

3、基于上述理論，研究和優(yōu)化產(chǎn)色氨酸的大腸埃希氏菌（escherichia?coli）tr2023d-1的產(chǎn)組氨酸性能，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmcc?no.27549（cn117778225a，已保藏）。

4、本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。

5、一種發(fā)酵生產(chǎn)l-組氨酸的方法，其包括如下步驟：

6、步驟1）制備一級(jí)種子液，步驟2）制備二級(jí)種子液，步驟3）發(fā)酵，步驟4）離心、過濾，步驟5）脫色，步驟6）結(jié)晶。

7、具體地，所述方法包括如下步驟：

8、步驟1）制備一級(jí)種子液：將產(chǎn)l-組氨酸的大腸埃希氏菌進(jìn)行活化，接種到lb液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)36h，得到一級(jí)種子液；

9、步驟2）制備二級(jí)種子液：將一級(jí)種子液按照15%的接種量接入到二級(jí)種子培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至od600值為8左右，得到二級(jí)種子液；

10、步驟3）發(fā)酵：將二級(jí)種子液按照8%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度36℃，通過流加葡萄糖溶液的維持還原糖含量為5g/l，發(fā)酵結(jié)束前4h停止流加葡萄糖溶液；通過流加25%氨水維持發(fā)酵罐內(nèi)ph在7.0，流加消泡劑消泡；發(fā)酵總時(shí)間為48h，即得l-組氨酸發(fā)酵液；

11、步驟4）離心、過濾：l-組氨酸發(fā)酵液進(jìn)入碟片離心機(jī)離心，收集上層液體，然后通過陶瓷膜進(jìn)行過濾，去除大分子蛋白質(zhì)，收集濾過液，然后經(jīng)過超濾膜進(jìn)行超濾，收集超濾液；

12、步驟5）脫色：往超濾液中按照1g：100ml的比例添加活性炭，溫度控制在75℃，攪拌脫色時(shí)間60min，然后再靜置30min，板框過濾去除活性炭，收集過濾液；

13、步驟6）結(jié)晶：將濾過液中添加氫氧化鈉，調(diào)節(jié)ph為7.6，然后以10℃/h的降溫速度進(jìn)行降溫，100rpm攪拌降溫結(jié)晶，待溫度降低至5℃時(shí)，停止攪拌，靜置析晶2h，然后離心分離濕晶體，70℃真空烘干，即得l-組氨酸產(chǎn)品。

14、優(yōu)選地，所述二級(jí)種子培養(yǎng)基組分為：蔗糖30g/l、磷酸二氫鉀5g/l、磷酸氫二鉀5g/l、酵母膏5g/l、七水硫酸鎂1g/l、七水硫酸亞鐵50mg/l、生物素0.1mg/l；ph控制在7.0。

15、優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：葡萄糖60g/l、玉米漿10g/l、硫酸銨8g/l、磷酸二氫鉀5g/l、檸檬酸2g/l、七水硫酸鎂1.5g/l、蘋果酸鈉0.4g/l、七水硫酸亞鐵100mg/l、吲哚丙酸10mg/l、硫胺素0.5mg/l、生物素0.2mg/l；ph控制在7.0。

16、優(yōu)選地，所述葡萄糖溶液的組分為：葡萄糖500g/l+一磷酸腺苷15g/l。

17、優(yōu)選地，所述陶瓷膜的截留分子量為10000da。

18、優(yōu)選地，所述超濾膜的截留分子量為500da。

19、優(yōu)選地，所述碟片離心機(jī)以5000rpm離心3min。

20、本發(fā)明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下幾個(gè)方面：

21、代謝網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)十分復(fù)雜的多酶同步催化反應(yīng)體系，僅僅改變其中的一步限速反應(yīng)，對(duì)產(chǎn)物合成的影響往往可能不會(huì)很大，因此要優(yōu)化某一代謝網(wǎng)絡(luò)，必須同時(shí)調(diào)節(jié)對(duì)產(chǎn)物有影響的主要節(jié)點(diǎn)，使代謝流量重新獲得分配，以利于目的產(chǎn)物的積累。本發(fā)明通過對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基以及刺激因子等條件的優(yōu)化，將產(chǎn)色氨酸的大腸埃希氏菌tr2023d-1的產(chǎn)組氨酸性能大幅提升，相應(yīng)地弱化了hmp途徑中色氨酸的合成效率。蘋果酸鹽可以抑制丙酮酸激酶的活性，減少丙酮酸的積累，造成磷酸烯醇式丙酮酸的積累，磷酸烯醇式丙酮酸是emp途徑限速酶磷酸果糖激酶的抑制劑，所以磷酸烯醇式丙酮酸的積累降低了磷酸果糖激酶的活性，從而降低了emp途徑的通量，緩解了emp和tca之間的代謝溢流。同時(shí)，葡萄糖總通量沒有變化，所以更多的葡萄糖進(jìn)入hmp合成途徑，相應(yīng)的提高了l-組氨酸的產(chǎn)率。

22、鄰氨基苯甲酸合成酶是色氨酸合成中的主要關(guān)鍵酶，吲哚丙酸作為鄰氨基苯甲酸合成酶的變構(gòu)抑制劑，通過弱化酶的活性，減少hmp途徑中色氨酸的合成代謝流量來增加組氨酸合成方向的代謝流。一磷酸腺苷（amp）是?atp?合成的直接前體,其可能通過合成atp或激活組氨酸合成中的關(guān)鍵酶來提高組氨酸的合成效率。

23、本發(fā)明分離純化工藝中，避免使用離子交換樹脂進(jìn)行分離，產(chǎn)生的廢水量小，對(duì)環(huán)境友好；本發(fā)明主要通過離心、過濾和脫色等工藝，避免使用有機(jī)溶劑，操作簡單可行，適合規(guī)模化生產(chǎn)。