本技術(shù)涉及細(xì)胞工程，尤其涉及一種體外三維生物模型及其構(gòu)建方法、應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、許多血管疾病，如炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤轉(zhuǎn)移，都與白細(xì)胞與血管內(nèi)皮的相互作用有關(guān)。聚集在病變附近、粘附或遷移到血管的白細(xì)胞數(shù)量可以作為血管疾病或藥物篩選的重要生物標(biāo)志物。目前研究白細(xì)胞與血管的相互作用，依靠“終末期”觀察，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)將血管固定并切開，以表征白細(xì)胞在血管上和血管中的位置，但是最需要的信息-白細(xì)胞粘附和跨內(nèi)皮遷移到血管的動(dòng)力學(xué)-尚未可用。細(xì)胞相互作用是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受到組織微環(huán)境的影響，而目前大部分體外研究模型都只有單一的血管（或血管內(nèi)皮）與免疫細(xì)胞作用，因此血管化的實(shí)質(zhì)器官組織模型對(duì)研究免疫細(xì)胞相互作用十分有必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本技術(shù)提供了一種體外三維生物模型及其構(gòu)建方法、應(yīng)用，能夠?qū)崿F(xiàn)體外研究血管化的實(shí)質(zhì)器官組織與免疫細(xì)胞的相互作用，還能夠培養(yǎng)細(xì)胞完整層且重力條件下細(xì)胞不容易粘附。

2、第一方面，本技術(shù)提供了一種體外三維生物模型的構(gòu)建方法，包括：將含有凝膠前體溶液的第一液體引入微流體網(wǎng)絡(luò)，所述微流體網(wǎng)絡(luò)包括第一培養(yǎng)通道、第二培養(yǎng)通道和基體通道，所述第一培養(yǎng)通道和所述第二培養(yǎng)通道之間相互隔開，且均與所述基體通道的同一側(cè)表面部分連通，所述第一培養(yǎng)通道、所述第二培養(yǎng)通道和所述基體通道在連通處分別限定出第一培養(yǎng)區(qū)、第二培養(yǎng)區(qū)和基體區(qū)。將所述第一液體引入所述微流體網(wǎng)絡(luò)的基體區(qū)，允許或引起所述第一液體凝膠化形成凝膠結(jié)構(gòu)，向所述微流體網(wǎng)絡(luò)的所述第一培養(yǎng)區(qū)引入含有上皮細(xì)胞或類器官細(xì)胞的第二液體，向所述微流體網(wǎng)絡(luò)的所述第二培養(yǎng)區(qū)引入含有內(nèi)皮細(xì)胞的第三液體，所述第二液體和第三液體中的細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)分化，獲得體外三維生物模型。所述上皮細(xì)胞包括各類器官上皮細(xì)胞，如原代、細(xì)胞系、類器官來(lái)源的皮膚上皮細(xì)胞（角質(zhì)形成細(xì)胞）、肺泡/肺氣管上皮細(xì)胞、腸道上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等。所述類器官包括各類腫瘤類器官和功能性類器官如肺類器官、肝臟類器官、腸道類器官、腎臟類器官、皮膚類器官等。

3、在一些實(shí)施方式中，所述第二液體為上皮細(xì)胞懸液和/或類器官細(xì)胞懸液，所述第二液體中的上皮細(xì)胞和/或類器官細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后形成上皮或類器官，所述第二液體中所述上皮細(xì)胞或所述類器官細(xì)胞的細(xì)胞接種量為1×104個(gè)/cm2至2×106個(gè)/cm2。示例性地，所述第二液體中所述上皮細(xì)胞或所述類器官細(xì)胞的細(xì)胞接種量為1×104個(gè)/cm2、1.5×104個(gè)/cm2、3×104個(gè)/cm2、5×104個(gè)/cm2、6×104個(gè)/cm2、8×104個(gè)/cm2、1×105個(gè)/cm2、2×105個(gè)/cm2、4×105個(gè)/cm2、6×105個(gè)/cm2、8×105個(gè)/cm2、1×106個(gè)/cm2、1.5×106個(gè)/cm2、2×106個(gè)/cm2或這些數(shù)值中任意兩者所組成的范圍內(nèi)的值。

4、在一些實(shí)施方式中，所述第三液體為血管內(nèi)皮細(xì)胞懸液，所述第三液體中的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后形成血管內(nèi)皮，所述第三液體中所述血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞接種量為5×104個(gè)/cm2至1×106個(gè)/cm2。示例性地，所述第三液體中所述血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞接種量為5×104個(gè)/cm2、6×104個(gè)/cm2、8×104個(gè)/cm2、1×105個(gè)/cm2、3×105個(gè)/cm2、5×105個(gè)/cm2、6×105個(gè)/cm2、8×105個(gè)/cm2、1×106個(gè)/cm2或這些數(shù)值中任意兩者所組成的范圍內(nèi)的值。

5、在一些實(shí)施方式中，所述第一液體中還包括間質(zhì)細(xì)胞，待所述第一液體凝膠化形成凝膠結(jié)構(gòu)后，繼續(xù)對(duì)所述第一液體中的間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，形成間質(zhì)層。所述間質(zhì)細(xì)胞包括各類器官成纖維細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等。所述第一液體中所述間質(zhì)細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml至5×106個(gè)/ml。示例性地，所述第一液體中所述間質(zhì)細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml、2×105個(gè)/cm2、4×105個(gè)/cm2、6×105個(gè)/cm2、8×105個(gè)/cm2、1×106個(gè)/cm2、1.5×106個(gè)/cm2、2×106個(gè)/cm2、3×106個(gè)/cm2、5×106個(gè)/cm2或這些數(shù)值中任意兩者所組成的范圍內(nèi)的值。

6、在一些實(shí)施方式中，所述第一液體凝膠化形成的凝膠結(jié)構(gòu)選自一種或多種下述的細(xì)胞外基質(zhì)：膠原蛋白i、膠原蛋白iv、纖維蛋白、纖維蛋白原、層粘連蛋白、matrigel、透明質(zhì)酸和合成水凝膠。

7、在一些實(shí)施方式中，所述微流體網(wǎng)絡(luò)還包含第三培養(yǎng)通道，所述第三培養(yǎng)通道、第一培養(yǎng)通道、第二培養(yǎng)通道之間相互隔開，且均與所述基體通道的同一側(cè)表面部分連通；所述第三培養(yǎng)通道和所述基體通道在連通處限定出第三培養(yǎng)區(qū)；所述構(gòu)建方法還包括含有細(xì)胞懸液、或凝膠前體溶液、或含細(xì)胞的凝膠前體溶液的第四液體引入微流體網(wǎng)絡(luò)的第三培養(yǎng)區(qū)。所述第三培養(yǎng)通道可以與所述第一培養(yǎng)通道、第二培養(yǎng)通道采用相同或者不同的通道深度。

8、第二方面，本技術(shù)提供了一種構(gòu)建免疫模型的方法，包括：獲得上述第一方面任一項(xiàng)構(gòu)建方法得到的體外三維生物模型，待所述體外三維生物模型分化成熟，在所述第二培養(yǎng)區(qū)加入免疫細(xì)胞懸液，進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，所述免疫細(xì)胞懸液中免疫細(xì)胞濃度為1×103個(gè)/ml至2×105個(gè)/ml。

9、動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的條件包括：在培養(yǎng)環(huán)境中以15min~120min搖擺3°~10°的速度進(jìn)行流動(dòng)灌注培養(yǎng)，免疫細(xì)胞是流動(dòng)狀態(tài)。示例性地，在一些實(shí)施方式中，在培養(yǎng)環(huán)境中以搖擺角度3°/120min進(jìn)行灌注培養(yǎng)；在另一些實(shí)施方式中，在培養(yǎng)環(huán)境中以搖擺角度7°/30min進(jìn)行灌注培養(yǎng)；在其他實(shí)施方式中，在培養(yǎng)環(huán)境中以搖擺角度7°/15min進(jìn)行灌注培養(yǎng)。

10、在一些實(shí)施方式中，在所述第二培養(yǎng)區(qū)加入免疫細(xì)胞懸液之前，對(duì)第一培養(yǎng)區(qū)的上皮進(jìn)行刺激，所述刺激包括化學(xué)刺激和物理刺激，所述化學(xué)刺激包括加入刺激藥物、刺激因子和其他刺激物質(zhì)，物理刺激包括力、電、光刺激，可選地，所述刺激因子包括炎癥因子，可選地，所述其他刺激物質(zhì)包括病人血液、細(xì)菌、病毒或納米粒子中的任一種。

11、第三方面，本技術(shù)提供了一種體外三維生物模型，所述體外三維生物模型包括凝膠基體，所述凝膠基體包括相對(duì)設(shè)置的上表面和下表面，所述上表面上設(shè)置有間隔開的第一區(qū)和第二區(qū)，所述第一區(qū)包含由上皮細(xì)胞和/或類器官細(xì)胞培養(yǎng)獲得的上皮和/或類器官，所述第二區(qū)包含由內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)獲得的內(nèi)皮，所述凝膠基體內(nèi)還包括由間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)獲得的間質(zhì)組織。

12、在一些實(shí)施方式中，所述體外三維生物模型為免疫殺傷檢測(cè)模型，其中，所述上皮和/或所述內(nèi)皮為經(jīng)過(guò)物理和或化學(xué)刺激后被激活的上皮和/或內(nèi)皮，且所述內(nèi)皮經(jīng)過(guò)包含免疫細(xì)胞的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。

13、本發(fā)明第一方面公開了上皮內(nèi)皮共培養(yǎng)模型的構(gòu)建方法，該模型具有動(dòng)態(tài)培養(yǎng)特性，實(shí)現(xiàn)組織上皮、內(nèi)皮結(jié)構(gòu)在同一側(cè)，通過(guò)間質(zhì)水凝膠層連接，且各腔室可獨(dú)立控制流路，有利于檢測(cè)應(yīng)用。本發(fā)明第二方面的體外三維生物模型，可以同時(shí)具備組織上皮、間質(zhì)、內(nèi)皮層，具有良好的功能性和仿真性。本發(fā)明第三方面公開了該模型應(yīng)用于細(xì)胞跨內(nèi)皮檢測(cè)的方法，該方法簡(jiǎn)單易實(shí)現(xiàn)，結(jié)果可視，改變了傳統(tǒng)上皮、內(nèi)皮為上下層的特點(diǎn)，簡(jiǎn)化了細(xì)胞跨內(nèi)皮檢測(cè)難度。