本發(fā)明屬于基因工程及發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及一種生產(chǎn)視黃醇棕櫚酸酯的解脂耶氏酵母重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、維生素a是二萜類化合物，也一種脂溶性維生素，被稱為“美容維生素”和“抗干眼病維生素”，廣泛應(yīng)用于飼料、醫(yī)藥化妝品和食品等領(lǐng)域。維生素a生物活性形式是視黃醇、視黃醛和視黃酸，它們?cè)谏矬w內(nèi)可以相互轉(zhuǎn)化，在生理功能上，視黃醇和視黃醛能夠維持正常的視覺，促進(jìn)視覺細(xì)胞內(nèi)感光色素的形成，調(diào)試眼睛適應(yīng)外界光線強(qiáng)弱的能力，降低夜盲癥和視力減退的發(fā)生，有助于對(duì)多種眼疾(如眼球干燥與結(jié)膜炎等)的治療；視黃醇還具有類固醇激素相似的作用，促進(jìn)糖蛋白的合成、機(jī)體生長(zhǎng)和發(fā)育，強(qiáng)壯骨骼，維護(hù)頭發(fā)、牙齒和牙床的健康；視黃酸能夠調(diào)控基因表達(dá)，減弱上皮細(xì)胞向鱗片狀的分化，增加上皮生長(zhǎng)因子的數(shù)量，維持上皮的完整與健全；維生素a還有一定的抗氧化作用，可以清除一些有害的自由基。在人體中，維生素a以棕櫚酸酯、亞油酸脂或油酸酯的形式儲(chǔ)存于肝臟中。

2、維生素a可從動(dòng)物組織中提取，但步驟繁瑣、提取率低、成本高。目前商業(yè)化的維生素a都是通過化學(xué)法合成的，合成方法分為roche法和basf法，都以檸檬醛為中間體。檸檬醛受制于巴斯夫、日本第一制藥等國(guó)際維生素中間體供應(yīng)商?；瘜W(xué)合成法能耗成本較高，而且需要復(fù)雜的純化步驟并易產(chǎn)生有毒害的異構(gòu)體以及一系列污染物。通過微生物將糖類等可再生的生物資源轉(zhuǎn)化成維生素a，溫和的反應(yīng)條件和強(qiáng)選擇專一性使其能夠?qū)崿F(xiàn)綠色清潔生產(chǎn)，可以擺脫對(duì)石油資源的依賴。

3、微生物發(fā)酵生產(chǎn)維生素a最大的瓶頸在于如何提高產(chǎn)量使其達(dá)到工業(yè)化水平，雖然目前有很多利用遺傳改造微生物工程菌合成維生素a的報(bào)道，但改造解脂耶氏酵母產(chǎn)維生素a卻鮮有報(bào)道，而且僅有報(bào)道的解脂耶氏酵母產(chǎn)維生素a只強(qiáng)化從乙酰輔酶a經(jīng)甲羥戊酸到視黃醇這一代謝通路的基因表達(dá)，沒有考慮充分利用脂質(zhì)在過氧化物酶體β氧化產(chǎn)生的巨量乙酰coa以及視黃醇不穩(wěn)定，導(dǎo)致無法突破產(chǎn)量以滿足工業(yè)生成的要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的第一個(gè)方面目的，在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中產(chǎn)視黃醇棕櫚酸酯的類胡蘿卜素合成途徑相關(guān)限速酶活性較低、乙酰coa供應(yīng)不充足等缺陷，提供一種核酸分子。

2、本發(fā)明的第二個(gè)方面目的，在于提供一種表達(dá)系統(tǒng)，含有上述的核酸序列。

3、本發(fā)明的第三個(gè)方面目的，在于提供一種重組細(xì)胞，含有上述的表達(dá)系統(tǒng)。

4、本發(fā)明第四個(gè)方面的目的，在于提供上述核酸分子、表達(dá)系統(tǒng)、重組細(xì)胞的應(yīng)用本發(fā)明的第五個(gè)方面目的，在于提供一種高產(chǎn)視黃醇棕櫚酸酯的方法。

5、本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

6、本發(fā)明的第一方面，提供一種核酸分子，包含：

7、(i)視黃醇棕櫚酸酯合成途徑相關(guān)基因；和

8、(ii)甲羥戊酸途徑相關(guān)基因；和

9、(iii)強(qiáng)化解脂耶氏酵母外源類胡蘿卜素合成途徑關(guān)鍵基因。

10、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述甲羥戊酸途徑相關(guān)基因包括催化乙酰輔酶a縮合成乙酰乙酰輔酶a的基因atob、催化乙酰乙酰輔酶a和乙酰輔酶a縮合成hmg-coa的基因hmgs，其中催化hmg-coa還原為甲羥戊酸的基因hmgr。

11、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述核酸分子還包括定位至過氧化物酶體的甲羥戊酸途徑。

12、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述定位至過氧化物酶體的甲羥戊酸途徑相關(guān)基因包括催化乙酰輔酶a縮合成乙酰乙酰輔酶a的基因atob、催化乙酰乙酰輔酶a和乙酰輔酶a縮合成hmg-coa的基因hmgs和催化hmg-coa還原為甲羥戊酸的基因hmgr；其中atob、hmgs和hmgr基因分別與編碼過氧化物酶體定位信號(hào)肽epts1(lgrgrrskl(seq?id?no.80))的基因序列的連接形成atobepts1、hmgsepts1和hmgrepts1基因；在此基礎(chǔ)上，atob、hmgs和hmgr基因編碼的蛋白羧基端都融合了過氧化物酶體定位信號(hào)肽epts1。甲羥戊酸途徑基因過表達(dá)并定位至過氧化物酶體，利用脂肪酸降解生成的乙酰輔酶a為前體能高效合成甲羥戊酸及下游化合物；epts1是一種增強(qiáng)型的過氧化物酶體定位信號(hào)，它能有效地將蛋白定位至過氧化物酶體。

13、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述atob來源于大腸桿菌。

14、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述atob來源于大腸桿菌bl21(de3)；但并不局限于此，只要來源于大腸桿菌菌株的atob均可以達(dá)到類似的效果。

15、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述hmgs和hmgr來源于解脂耶氏酵母；優(yōu)選為來源于解脂耶氏酵母w29。

16、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述atobepts1優(yōu)化序列如seq?id?no:1所示，hmgsepts1優(yōu)化序列如seq?id?no:2所示，hmgrepts1優(yōu)化序列如seq?id?no:3所示。

17、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述強(qiáng)化解脂耶氏酵母外源β-胡蘿卜素合成途徑關(guān)鍵基因包括：催化甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸-5-磷酸的基因erg12、催化甲羥戊酸-5-磷酸生成甲羥戊酸-5-焦磷酸的基因erg8、催化甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧生成異戊二烯焦磷酸的基因erg19、催化異戊二烯焦磷酸異構(gòu)為二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi、催化異戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸生成法尼基焦磷酸的基因erg20、催化法尼基焦磷酸結(jié)合一分子異戊二烯焦磷酸生成雙香葉基焦磷酸的基因ggs1、直接催化二甲烯丙基焦磷酸生成雙香葉基焦磷酸的多功能性酶基因gps、將外源的催化茄紅素脫氫生成番茄紅素的基因carb、催化兩分子雙香葉基焦磷酸生成茄紅素以及催化番茄紅素環(huán)化生成β-胡蘿卜素的雙功能基因carrp。

18、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述erg12、erg8、erg19、erg20和ggs1來源于解脂耶氏酵母。

19、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述erg12、erg8、erg19、erg20和ggs1來源于解脂耶氏酵母w29。

20、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述gps來源于古細(xì)菌硫細(xì)菌。

21、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述carb和carrp來源于卷枝毛霉。

22、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述carb基因的優(yōu)化序列如seq?id?no:4所示，所述carrp基因的優(yōu)化序列如seq?id?no:5所示。

23、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述視黃醇棕櫚酸酯合成途徑相關(guān)基因包括β-胡蘿卜素15，15’-單加氧酶基因blh、視黃醇結(jié)合蛋白的基因crbp以及催化視黃醇生成視黃醇棕櫚酸酯的基因lrat。

24、優(yōu)選地，所述blh來源于海洋細(xì)菌66a03。

25、優(yōu)選地，所述crbp和lrat來源于人類基因組。

26、本發(fā)明的第二方面，提供一種表達(dá)系統(tǒng)，包含本發(fā)明第一方面所述的核酸分子。

27、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，將所述核酸分子的基因拆解為1個(gè)或多個(gè)組別，分別插入于不同的表達(dá)載體中。

28、優(yōu)選地，所述表達(dá)載體的骨架質(zhì)粒包括puc、pbr322、pacyc、pet、psc101。

29、優(yōu)選地，所述puc包括puc18、puc19。

30、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，為了確保個(gè)基因可以在表達(dá)系統(tǒng)或者重組細(xì)胞中高效表達(dá)，在每個(gè)基因的上游添加啟動(dòng)子序列，下游增加終止子序列。

31、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所選用的啟動(dòng)子序列包括但不限于：ptef、pexp、pfba和pgpd。

32、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述終止子序列包括但不限于：tlip、tidi、txpr2、tcyc1、mig1t。

33、本發(fā)明的第三方面，提供一種重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞包括本發(fā)明第一方面所述的核酸分子或本發(fā)明第二方面所述的表達(dá)系統(tǒng)。

34、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述核酸分子插入于所述細(xì)胞的基因組中。

35、更進(jìn)一步地，所述核酸分子通過非同源性重組生物方式插入于所述細(xì)胞的基因組中。

36、本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，通過非同源性重組生物方式插入于所述細(xì)胞的基因組中是為了得到更多可能穩(wěn)定遺傳的菌株，僅轉(zhuǎn)化上述表達(dá)系統(tǒng)同樣可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。

37、此外，非同源性重組相比定點(diǎn)嵌入的方式，有幾率獲得多次嵌入的更高效的重組細(xì)胞或重組菌。

38、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為酵母細(xì)胞。

39、在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方式中，所述酵母細(xì)胞為解脂耶氏酵母。

40、在本發(fā)明的一些更優(yōu)選實(shí)施方式中，所述解脂耶氏酵母為解脂耶氏酵母ztq5320。

41、本發(fā)明的第四方面，提供本發(fā)明第一方面所述的核酸分子、第二方面所述的表達(dá)載體和/或第三方面所述的重組細(xì)胞在食品、化工或制藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

42、本發(fā)明還提供本發(fā)明第一方面所述的核酸分子、第二方面所述的表達(dá)載體和/或第三方面所述的重組細(xì)胞在生產(chǎn)視黃醇棕櫚酸酯和/或制備生產(chǎn)視黃醇棕櫚酸酯的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

43、本發(fā)明的第四方面，提供一種生產(chǎn)視黃醇棕櫚酸酯的方法，通過培養(yǎng)上述的重組細(xì)胞，得到視黃醇棕櫚酸酯。

44、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述包括在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，通過培養(yǎng)上述的重組細(xì)胞，破胞萃取到視黃醇棕櫚酸酯。

45、具體地，重組細(xì)胞的培養(yǎng)方法包括以下步驟：

46、一級(jí)種子液的培養(yǎng)；

47、二級(jí)種子液的培養(yǎng)；

48、發(fā)酵罐培養(yǎng)。

49、更具體地，重組細(xì)胞的培養(yǎng)方法包括以下步驟：

50、一級(jí)種子液的培養(yǎng)：將重組菌單菌落接種到含有液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，28～32℃、搖床轉(zhuǎn)速180～200rpm，培養(yǎng)24～48小時(shí)，得到一級(jí)種子液。

51、二級(jí)種子液的培養(yǎng)：將一級(jí)種子液按1％-5％(v/v)接種量轉(zhuǎn)接到含有液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，28～32℃、搖床轉(zhuǎn)速180～200rpm，培養(yǎng)到od600達(dá)到10，得到二級(jí)種子液。

52、發(fā)酵罐培養(yǎng)：將二級(jí)種子液按8～12％(wt)接種量轉(zhuǎn)接至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度28～32℃、攪拌速度300～800rpm、通氣量大于2l/min、ph6.5～7.0和溶氧22～28％以上的條件下培養(yǎng)，以55～65％葡萄糖儲(chǔ)液繼續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵。

53、優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基)的成分包括：8～12g/l酵母膏、15～25g/l蛋白胨和50～70g/l葡萄糖。

54、優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分包括：25～35g/l酵母膏、50～70g/l蛋白胨和80～120g/l葡萄糖。

55、本發(fā)明的有益效果是：

56、本發(fā)明提供了一種核酸分子，包含視黃醇棕櫚酸酯的合成途徑，構(gòu)建了甲羥戊酸途徑和同時(shí)強(qiáng)化解脂耶氏酵母外源類胡蘿卜素合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)，還引入了定位至過氧化物酶體的甲羥戊酸途徑；本發(fā)明還提供了包含上述核酸分子的表達(dá)載體、重組細(xì)胞，通過在解脂耶氏酵母中引入上述途徑，顯著提高了視黃醇棕櫚酸酯產(chǎn)量，產(chǎn)量可達(dá)5g/l。