本發(fā)明涉及生物育種領(lǐng)域。具體的說，提供了一種快速鑒定轉(zhuǎn)基因玉米ld05純合子和雜合子的檢測(cè)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、受玉米基因型的影響，只有個(gè)別自交系材料適用于現(xiàn)有的玉米遺傳轉(zhuǎn)化方法(黎裕,王天宇.玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)研發(fā)與應(yīng)用現(xiàn)狀及展望.玉米科學(xué),2018,26(2):1-15)。優(yōu)良目標(biāo)性狀主要是通過回交轉(zhuǎn)育方式導(dǎo)入玉米親本自交系中，經(jīng)過多代回交轉(zhuǎn)育獲得目標(biāo)性狀和表型都接近預(yù)期的回交材料后，通過自交方式獲得純合個(gè)體(周洪昌,宋偉,王鳳格,等.玉米絲黑穗病分子標(biāo)記輔助選擇育種中前景引物與背景引物的篩選[j].分子植物育種,2011,9(04):450-456)。因此，轉(zhuǎn)基因玉米的目標(biāo)性狀準(zhǔn)確快速的導(dǎo)入育種常規(guī)自交系至關(guān)重要，在回交轉(zhuǎn)育過程中利用分子檢測(cè)手段有效縮短回交轉(zhuǎn)育進(jìn)程具有重要意義。

2、純雜合鑒定方法主要用于確定育種材料的遺傳純度，對(duì)于確認(rèn)材料的遺傳背景、提高育種效率具有重要的意義。純合子能保證品種的遺傳特性穩(wěn)定，有助于性狀的穩(wěn)定性和一致性；而雜合子需要在后代中通過選擇來穩(wěn)定這些性狀。提前鑒定育種材料的純雜合特性，可以為育種家提供更為合適的親本，以實(shí)現(xiàn)更高效的育種目標(biāo)。同時(shí)，最大限度的避免因使用非純合材料而導(dǎo)致的資源浪費(fèi)和育種失敗。純雜合鑒定方法的應(yīng)用范圍十分廣泛。在品種選育，尤其是新種質(zhì)資源開發(fā)時(shí)，準(zhǔn)確的鑒定純合子能確保所選育的品種具有預(yù)期的遺傳特性；在開展種質(zhì)資源鑒定和對(duì)已有的種質(zhì)資源進(jìn)行評(píng)估時(shí)，往往需要了解其純度和雜合情況；在進(jìn)行基因組研究時(shí)，確保研究材料的遺傳背景一致是獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要前提。純雜合鑒定的傳統(tǒng)方法有ssr、snp等分子標(biāo)記技術(shù)和表型分析等，在一些具有豐富多樣性的育種材料中，鑒定純合體和雜合體可能會(huì)受到遺傳背景復(fù)雜性的影響，增加了鑒定的難度，難以保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。隨著基因組測(cè)序和生物信息技術(shù)的發(fā)展，借助強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析能力，高通量的測(cè)序技術(shù)和高精度的分子標(biāo)記數(shù)據(jù)解析已應(yīng)用于純合親本的選育中，可以確保結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，但會(huì)增加檢測(cè)的成本和周期。對(duì)于轉(zhuǎn)基因育種材料來說，純合子的外源基因能穩(wěn)定遺傳，確保后代具有相同的遺傳特性；而雜合子會(huì)因基因分離重組等因素導(dǎo)致后代丟失外源基因和目標(biāo)性狀。因此，轉(zhuǎn)基因的純合狀態(tài)這對(duì)于維持轉(zhuǎn)基因品種目標(biāo)性狀的遺傳穩(wěn)定性十分重要。

3、抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米ld05是山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將自主研發(fā)的新型抗蟲融合基因m2cryab-vip3a和耐除草劑基因bar串聯(lián)導(dǎo)入受體材料，并以骨干自交系鄭58為輪回親本進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，獲得的抗蟲耐除草劑且擁有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)基因玉米新材料。經(jīng)過多代回交轉(zhuǎn)育獲得的高代轉(zhuǎn)基因回交材料在具有抗蟲耐除草劑的目標(biāo)性狀的同時(shí)，其農(nóng)藝性狀也與回交親本接近。此時(shí)，建立準(zhǔn)確、特異的轉(zhuǎn)基因純雜合鑒定方法，快速獲得目標(biāo)基因純合系，對(duì)于保證后代目標(biāo)性狀的遺傳穩(wěn)定性是非常必要的。

4、本發(fā)明在ld05插入序列左右邊界設(shè)計(jì)多組不同的pcr引物進(jìn)行擴(kuò)增，可快速、準(zhǔn)確且高通量的鑒定外源插入序列的純雜合性，建立起了一種高效的純合轉(zhuǎn)基因玉米ld05的鑒定方法，從而有效縮短育種周期，為優(yōu)良轉(zhuǎn)化體快速走向產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供有用信息。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種快速、準(zhǔn)確鑒定轉(zhuǎn)基因玉米ld05純合子的檢測(cè)方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明在ld05插入序列左右邊界設(shè)計(jì)多組不同的pcr引物進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，篩選到能用于快速鑒定轉(zhuǎn)基因玉米ld05的純雜合性的引物組合。

3、本發(fā)明提供了一種用于鑒定純合轉(zhuǎn)基因玉米ld05的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)包括由如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示序列引物構(gòu)成的引物對(duì)a，以及由如seq?idno.1和seq?id?no.3所示序列引物構(gòu)成的引物對(duì)b。

4、本發(fā)明還提供了檢測(cè)純合轉(zhuǎn)基因玉米ld05的試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的引物對(duì)組合。

5、本發(fā)明還提供了檢測(cè)純合轉(zhuǎn)基因玉米ld05的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

6、i)以待測(cè)樣品基因組dna為模板，用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)a和引物對(duì)b均能擴(kuò)增出目的條帶，則待測(cè)樣品為雜合ld05；

7、ii)以待測(cè)樣品基因組dna為模板，用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)a不能擴(kuò)增出目的條帶，用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)b能擴(kuò)增出目的條帶，則待測(cè)樣品為純合ld05；

8、iii)以待測(cè)樣品基因組dna為模板，用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)a能擴(kuò)增出目的條帶，用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)b不能擴(kuò)增出目的條帶，則待測(cè)樣品不是ld05。

9、進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了權(quán)利要求1所述的引物對(duì)組合、權(quán)利要求2所述的試劑盒、權(quán)利要求3所述的方法在鑒定純合轉(zhuǎn)基因玉米ld05中的應(yīng)用。

10、本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明基于普通pcr技術(shù)，篩選出一組具有較高的擴(kuò)增效率和檢測(cè)靈敏度的引物組合，可以快速、準(zhǔn)確且高通量的完成轉(zhuǎn)基因玉米ld05的純合子和雜合子鑒定；鑒定出來的純合ld05可作為親本建立轉(zhuǎn)基因純系，從而加速培育出抗蟲耐除草劑性狀優(yōu)良、遺傳性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因玉米新品種。

11、在本發(fā)明用于檢測(cè)玉米ld05純雜合特性的方法中，以下定義和方法可以更好地定義本發(fā)明和指導(dǎo)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明，除非另作說明，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)的用法來理解術(shù)語。

12、術(shù)語“基因”是指表達(dá)特定蛋白的核酸片段，包括編碼序列前的調(diào)節(jié)序列(5’非編碼序列)和編碼序列后的調(diào)節(jié)序列(3’非編碼序列)?！疤烊换颉笔侵柑烊话l(fā)現(xiàn)具有其自身調(diào)節(jié)序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含非天然發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)和編碼序列?！皟?nèi)源基因”是指天然基因，所述天然基因位于生物體基因組中它的天然位置?！巴庠椿颉笔乾F(xiàn)存在于生物的基因組中且原來不存在的外來基因，也指經(jīng)轉(zhuǎn)基因步驟導(dǎo)入受體細(xì)胞的基因。外源基因可以包含插入非天然生物體的天然基因或嵌合基因?！稗D(zhuǎn)基因”是通過轉(zhuǎn)化程序已經(jīng)被引入基因組的基因。植物基因組中重組dna已被插入的位點(diǎn)可以稱為“插入位點(diǎn)”或“靶位點(diǎn)”。

13、“側(cè)翼dna”可以包含天然存在于例如植物的生物體中的基因組或通過轉(zhuǎn)化過程引入的外源(異源)dna，例如與轉(zhuǎn)化事件相關(guān)的片段。因此，側(cè)翼dna可以包括天然和外源dna的組合。在本發(fā)明中，“側(cè)翼區(qū)”或“側(cè)翼序列”或“基因組邊界區(qū)”或“基因組邊界序列”是指至少3、5、10、11、15、20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000堿基對(duì)或更長(zhǎng)的序列，其位于最初外源插入dna分子的直接上游或下游并且與最初外源插入dna分子相鄰。當(dāng)該側(cè)翼區(qū)位于上游時(shí)，其也可以稱為“左邊界側(cè)翼”或“5’側(cè)翼”或“5’基因組側(cè)翼區(qū)”或“基因組5’側(cè)翼序列”等。當(dāng)該側(cè)翼區(qū)位于下游時(shí)，其也可以稱為“右邊界側(cè)翼”或“3’側(cè)翼”或“3’基因組側(cè)翼區(qū)”或“基因組3’側(cè)翼序列”等。

14、引起外源dna的隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)化程序會(huì)導(dǎo)致含有不同側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)化事件，所述不同側(cè)翼區(qū)是每個(gè)轉(zhuǎn)化事件所特異性含有的。當(dāng)重組dna通過傳統(tǒng)雜交被引入植物時(shí)，其側(cè)翼區(qū)通常不會(huì)改變。轉(zhuǎn)化事件也會(huì)含有異源插入物dna和基因組dna的段之間或兩段基因組dna之間或兩段異源dna之間的獨(dú)特的接合?！敖雍稀笔莾蓚€(gè)具體的dna片段連接的點(diǎn)。例如，接合存在于插入物dna連接側(cè)翼dna的位置。接合點(diǎn)還存在于轉(zhuǎn)化的生物體中，其中兩個(gè)dna片段以修飾自天然生物體中發(fā)現(xiàn)的方式的連接在一起?！敖雍蟙na”是指包含接合點(diǎn)的dna。

15、本發(fā)明提供了稱為ld05的轉(zhuǎn)基因玉米事件及其后代，所述轉(zhuǎn)基因玉米事件ld05即為玉米ld05，其包括轉(zhuǎn)基因玉米事件ld05的植物和種子及其植物細(xì)胞或其可再生部分，所述轉(zhuǎn)基因玉米事件ld05的植物部分，包括但不限于細(xì)胞、花粉、胚珠、花、芽、根、莖、葉和來自玉米ld05的產(chǎn)物，例如玉米籽、玉米油、玉米粉、玉米面、玉米棒子和留在玉米作物田間的生物量。

16、術(shù)語“引物”是一段分離的核酸分子，其通過核酸雜交，退火結(jié)合到互補(bǔ)的目標(biāo)dna鏈上，在引物和目標(biāo)dna鏈之間形成雜合體，然后在聚合酶(例如dna聚合酶)的作用下，沿目標(biāo)dna鏈延伸。本發(fā)明的引物對(duì)涉及其在目標(biāo)核酸序列擴(kuò)增中的應(yīng)用，例如，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)或其他常規(guī)的核酸擴(kuò)增方法。引物的長(zhǎng)度一般是11個(gè)多核苷酸或更多，優(yōu)選的是18個(gè)多核苷酸或更多，更優(yōu)選的是24個(gè)多核苷酸或更多，最優(yōu)選的是30個(gè)多核苷酸或更多。這種引物在高度嚴(yán)格雜交條件下與目標(biāo)序列特異性地雜交。盡管不同于目標(biāo)dna序列且對(duì)目標(biāo)dna序列保持雜交能力的引物是可以通過常規(guī)方法設(shè)計(jì)出來的，但是，優(yōu)選的，本發(fā)明中的引物與目標(biāo)序列的連續(xù)核酸具有完全的dna序列同一性。

17、關(guān)于使用特定的擴(kuò)增引物對(duì)目標(biāo)核酸序列進(jìn)行的擴(kuò)增(例如，通過pcr)，“嚴(yán)格條件”指的是在dna熱擴(kuò)增反應(yīng)中僅允許引物對(duì)目標(biāo)核酸序列發(fā)生雜交的條件，具有與目標(biāo)核酸序列相應(yīng)的野生型序列(或其互補(bǔ)序列)的引物，能夠與所述目標(biāo)核酸序列結(jié)合，并且優(yōu)選產(chǎn)生唯一的擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物即擴(kuò)增子。

18、術(shù)語“特異性結(jié)合(目標(biāo)序列)”是指在嚴(yán)格雜交條件下引物僅與包含目標(biāo)序列的樣品中的目標(biāo)序列發(fā)生雜交。

19、如本發(fā)明使用的，“經(jīng)過擴(kuò)增的dna”或“擴(kuò)增子”是指作為核酸模板一部分的目標(biāo)核酸序列的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。例如，為了確定玉米植物是否由含有本發(fā)明轉(zhuǎn)基因玉米事件ld05通過有性雜交方式產(chǎn)生，或采集自田地的玉米樣品是否包含轉(zhuǎn)基因玉米事件ld05，或玉米提取物，例如玉米油是否包含轉(zhuǎn)基因玉米事件ld05，從玉米植物組織樣品或提取物提取的dna可以通過使用引物對(duì)的核酸擴(kuò)增方法以產(chǎn)生對(duì)于轉(zhuǎn)基因玉米事件ld05的dna的存在是診斷性的擴(kuò)增子。所述引物對(duì)包括一個(gè)來源于植物基因組中與插入的外源dna插入位點(diǎn)相鄰的側(cè)翼序列的第一引物，和來源于插入的外源dna的第二引物。擴(kuò)增子具有一定長(zhǎng)度和序列，所述序列對(duì)所述轉(zhuǎn)基因玉米事件ld05也是診斷性的。

20、擴(kuò)增子的長(zhǎng)度范圍可以是引物對(duì)的結(jié)合長(zhǎng)度加上一個(gè)核苷酸堿基對(duì)，優(yōu)選加上約五十個(gè)核苷酸堿基對(duì)，更優(yōu)選加上約兩百五十個(gè)核苷酸堿基對(duì)，最優(yōu)選加上約四百五十個(gè)核苷酸堿基對(duì)或更多。

21、可選的，引物對(duì)可以來源于插入dna兩側(cè)的側(cè)翼基因組序列，以產(chǎn)生包括整個(gè)插入核苷酸序列的擴(kuò)增子。來源于植物基因組序列的引物對(duì)中的一個(gè)可以位于距插入dna序列一定距離處，該距離的范圍可以為一個(gè)核苷酸堿基對(duì)到約兩萬個(gè)核苷酸堿基對(duì)。術(shù)語“擴(kuò)增子”的使用特別排除了在dna熱擴(kuò)增反應(yīng)中形成的引物二聚體。

22、下面通過附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。