本發(fā)明屬于基因工程，具體涉及一種高生物活性重組人源ⅹⅶ型膠原蛋白氨基酸序列及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、人源xvii型膠原蛋白是一種跨膜型非成纖維膠原蛋白，其為三條相同α1(xvii)鏈構(gòu)成的均相三聚體，單鏈分子量為180kda，其中包含有70kda的球狀胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，一個跨膜域和120kda的胞外膠原結(jié)構(gòu)域，具有非常強的熱穩(wěn)定性。人源xvii型膠原蛋白的n端位于細胞質(zhì)中，c端位于細胞外基質(zhì)中，分為胞內(nèi)、跨膜、胞外三大類結(jié)構(gòu)域，又可根據(jù)是否具有典型的(gly-x-y)n氨基酸重復序列及能否形成三螺旋區(qū)域分為16個非三螺旋區(qū)和15個三螺旋區(qū)，這些膠原域和非膠原域共同參與執(zhí)行了與細胞外基質(zhì)間的相互作用。主要在表皮基底角質(zhì)形成細胞中表達。

2、人源xvii型膠原蛋白作為細胞中半橋粒的一種重要組成成分，對維持基底膜與細胞外基質(zhì)間的緊密連接具有重要作用，可調(diào)控上皮細胞的黏附、分離和發(fā)育分化，對角化細胞的分化和再生有重要作用。ⅹⅶ型膠原蛋白是創(chuàng)傷修復過程中的重要調(diào)節(jié)子，在傷口愈合的過程中，基底層角質(zhì)細胞的ⅹⅶ型膠原蛋白的表達和切割被強烈誘導。ⅹⅶ型膠原蛋白120kda的胞外結(jié)構(gòu)域會被a解離素和金屬蛋白酶(adam)9和10切割下來。另外，在靜止中的毛囊干細胞中，ⅹⅶ型膠原蛋白的表達是降低的，敲除ⅹⅶ型膠原蛋白的基因，會導致毛發(fā)脫落，因此ⅹⅶ型膠原蛋白在毛發(fā)的生長中起著關(guān)鍵作用。

3、然而xvii型膠原蛋白在人體中含量極少，且xvii型膠原蛋白在動物體內(nèi)含量同樣極為稀少，提取難度也非常大，無法依靠傳統(tǒng)的酸、堿、酶解法處理動物組織獲得，少量的提取只能滿足科研需求，無法量產(chǎn)，沒有大量應(yīng)用的可能性，同時不可避免的存在動物源疾病感染、免疫排斥或過敏反應(yīng)和潛在的病毒等生物安全性隱患。因此隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在解決此類問題的主要方式是通過基因工程等生物技術(shù)來獲得重組ⅹⅶ型膠原蛋白。

4、例如申請?zhí)枮閏n110845603a，申請日2019年10月31日的中國專利為公布了一種大腸桿菌表達的人膠原蛋白17型多肽、其生產(chǎn)方法和用途，所述多肽包含seq?id?no.9的63至1496個連續(xù)的氨基酸殘基，其中所述多肽包含(a)m所示的序列或者由(a)m所示的序列組成，其氨基酸序列為三個多肽的中任意一個1-10個串聯(lián)重復，生產(chǎn)的重組人源膠原蛋白具有非常好的親水性和穩(wěn)定性，其氨基酸組成與天然膠原蛋白氨基酸序列相應(yīng)部分100％相同，應(yīng)用于人體不會產(chǎn)生免疫排斥和過敏反應(yīng)，可以廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥和化妝品行業(yè)；公開號為cn116640231a，申請日為2023年6月9日的中國專利公開了一種重組人源化17型膠原多肽及其制備方法，所述膠原多肽rhc17icd的氨基酸序列由人17型膠原的胞內(nèi)區(qū)(icd)氨基酸序列組成或包含icd區(qū)氨基酸序列，通過大腸桿菌系統(tǒng)實現(xiàn)了人17型膠原icd區(qū)的高效穩(wěn)定表達，并且通過提供的純化方法可獲得純度達到90％以上的目的蛋白，克服了對人17型膠原icd區(qū)重組高效表達的局限性和產(chǎn)物穩(wěn)定性差、易降解等問題。但是上述發(fā)明申請均采用了大腸桿菌表達系統(tǒng)，大腸桿菌是原核生物，不能對蛋白質(zhì)進行翻譯后修飾，因此大腸桿菌系統(tǒng)很難表達具有天然高級結(jié)構(gòu)的三螺旋膠原蛋白，此外通過大腸桿菌表達獲得的蛋白還可能存在內(nèi)毒素污染和生物學活性較低等問題。

5、此外，一般來說跨膜蛋白于真核細胞中表達時并不會分泌于胞外，而是會固定于細胞膜上，而xvii型膠原蛋白的氨基酸序列很長(1497個氨基酸)、蛋白質(zhì)分子量較大(180kda)，理論上很難有效分泌于胞外且易于降解，要成功表達就需要進行相關(guān)序列的選取。xvii型膠原蛋白的胞外域(489-1497aa)中，存在15個膠原域和16個非膠原域，這些結(jié)構(gòu)域共同參與了與細胞外基質(zhì)的相互作用，是參與維持基底膜穩(wěn)定性的重要部分。畢赤酵母表達蛋白路徑克服了動物源以及大腸桿菌表達的膠原蛋白的缺陷，酵母表達系統(tǒng)具備分子伴侶以及蛋白翻譯后修飾的酶(如糖基化、羥基化、乙?；傅?，非常適合于具有高級結(jié)構(gòu)的三螺旋膠原蛋白的形成。

6、因此，在選取氨基酸序列使其能在保持畢赤酵母表達體系優(yōu)點(尤其是分泌表達)的前提下，利用基因工程開發(fā)具有優(yōu)異的細胞粘附活性、促細胞遷移活性以及促進組織再生和毛囊修復再生生物學活性的重組人源ⅹⅶ型膠原蛋白，設(shè)計其操作簡單，產(chǎn)量可觀，易于擴大生產(chǎn)的制備方法，對于目前重組人源ⅹⅶ型膠原蛋白的研究與應(yīng)用具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種高生物活性重組人源ⅹⅶ型膠原蛋白氨基酸序列及其制備方法與應(yīng)用，所述膠原蛋白不僅溶解性好，發(fā)酵后期蛋白狀態(tài)能夠維持穩(wěn)定現(xiàn)象，而且還具有優(yōu)異的細胞粘附活性、促細胞遷移活性以及促進組織再生和毛囊修復再生的生物學活性。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明的目的之一在于提供一種高生物活性重組人源ⅹⅶ型膠原蛋白的制備方法，包括以下步驟：

4、s1、對人源ⅹⅶ型膠原蛋白α1鏈的氨基酸序列進行分析，挑選該蛋白非跨膜區(qū)不易被內(nèi)源或外源蛋白酶降解的部分氨基酸片段(489-1497aa)，將選取的片段重復拼接得到重組膠原蛋白基因片段(col17a)n，并在重組膠原蛋白前引入來源于不同甲基營養(yǎng)型酵母的直系同源啟動子，優(yōu)化合成挑選的(col17a)n、啟動子片段；

5、s2、利用pcr克隆獲取連接片段，而后通過gibson?assembly無縫連接技術(shù)將膠原蛋白片段(col17a)n、啟動子片段和ppic9k載體骨架片段連接，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒ppic9k-(col17a)n；

6、s3、巴斯德畢赤酵母細胞p.pastoris?gs115感受態(tài)的制備與ppic9k-(col17a)n的人源ⅹⅶ型膠原蛋白表達。

7、進一步地，所述s1中重組膠原蛋白基因片段(col17a)n中，col17a為如seq?idno.1所示的氨基酸序列，或在seq?id?no.1基礎(chǔ)上進行一定程度上的氨基酸替換、插入、取代、添加或缺失修改后的氨基酸序列，或與seq?id?no.1氨基酸序列具有大于80％同源性的氨基酸序列。

8、進一步地，n為大于或等于1的整數(shù)。

9、進一步地，所述s1中直系同源啟動子為來源于pichia?pastoris的aox1啟動子或hansenula?polymorpha的fmd啟動子。

10、進一步地，hansenula?polymorpha的fmd啟動子(ncbi序列號：ay550077.1)經(jīng)改造后合成，核苷酸序列(1-639aa)如seq?id?no.2所示。

11、進一步地，所述s2中pcr克隆包括以下步驟：

12、s2-1、通過使用pcr技術(shù)對表達載體ppic9k、膠原片段和啟動子片段進行pcr克隆來獲取連接片段，將克隆得到的膠原蛋白、啟動子和表達載體ppic9k片段分別按照濃度比為3:4:1混合；

13、s2-2、使用gibson?assembly無縫連接技術(shù)將s21獲得的膠原蛋白片段、啟動子和ppic9k載體骨架片段進行連接，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒ppic9k-(col17a)n；

14、s2-3、金屬浴孵育連接混合物，然后將連接混合物通過熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞中，37℃過夜培養(yǎng)后挑取在含氨芐青霉素鈉和卡那霉素平板上生長的陽性單克隆進行菌落pcr初步驗證，驗證成功的單菌落接種在5ml?lb試管中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進行測序，確認重組基因與所設(shè)計一致。

15、進一步地，所述s2-3中驗證引物為col17a-f/r。

16、進一步地，所述s2-3中連接混合物經(jīng)過50℃金屬浴孵育1h。

17、進一步地，所述s2-3中驗證成功的單菌落在5ml?lb試管中37度培養(yǎng)16h。

18、進一步地，所述s3中g(shù)s115感受態(tài)的制備與ppic9k-(col17a)n的表達包括以下步驟：

19、s3-1、電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備：將gs115菌液在ypd平板劃線活化并培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至有單菌落長出，挑取單菌落接種至5ml?ypd液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，而后以1‰的接種量將種子液接種于50m?ypd中培養(yǎng)，收集菌液并離心，棄上清，重復操作后用d-山梨醇溶液重懸菌體并按100μl/管分裝成小份；

20、s3-2、取已經(jīng)線性化的重組質(zhì)粒ppic9k-(col17a)n片段與巴斯德畢赤酵母感受態(tài)細胞p.pastoris?gs115混勻，混勻后迅速轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)杯中進行電擊轉(zhuǎn)化以使重組質(zhì)粒片段進入感受態(tài)細胞p.pastoris?gs115中；

21、s3-3、將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細胞p.pastoris?gs115涂布在md平板后倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到平板上有單菌落出現(xiàn)，挑取單菌落培養(yǎng)提取基因組進行pcr驗證，而后測序驗證轉(zhuǎn)化是否成功；

22、s3-4、將測序驗證正確的重組菌分別轉(zhuǎn)染在g418濃度為500μg/ml-4mg/ml的ypd平板上進行高拷貝重組菌株篩選，選擇能在高濃度g418平板上生長的重組菌進行活化而后保菌；

23、s3-5、將s3-4中活化重組菌轉(zhuǎn)接到新的ypd液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；

24、s3-6、以1％的接種量將過夜活化的菌液轉(zhuǎn)接到總體系為5ml的bmgy液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)、離心收集菌體，而后用50ml的bmmy液體培養(yǎng)基懸浮離心收集的菌體并發(fā)酵培養(yǎng)，每隔24h向培養(yǎng)液中添加終濃度為0.5-1％的甲醇進行誘導表達；

25、s3-7、誘導表達96h后將培養(yǎng)液離心，分別收集誘導24h、48h、72h和96h上清液進行sds-page蛋白電泳來驗證高生物活性重組人源ⅹⅶ型膠原蛋白的表達情況。

26、進一步地，所述s3-1中將gs115菌液在ypd平板劃線活化，并在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至有單菌落長出，挑取單菌落接種至5ml?ypd液體培養(yǎng)基中，在30℃、220rpm的條件下培養(yǎng)18h。

27、進一步地，所述s3-1中以1‰的接種量將種子液接種于50ml?ypd中，培養(yǎng)至od?600為1.3-1.5，收集菌液并于4℃、5000rpm條件下離心5min，棄上清，重復2次，菌體用1m/l?d-山梨醇溶液重懸菌體并按100μl/管分裝成小份。

28、進一步地，所述s3-2中取1μg已經(jīng)線性化的質(zhì)粒ppic9k-(col17a)n片段與s3-1中的100μl酵母感受態(tài)gs115混勻，混勻后迅速轉(zhuǎn)移到0.2cm的預冷電轉(zhuǎn)杯中，至于冰上5min。

29、進一步地，所述s3-2中電擊轉(zhuǎn)化參數(shù)如下：電擊電壓2kv，電容25μf，電阻200ω，電擊時間5msec。

30、進一步地，所述s3-2中電擊結(jié)束后立刻往電轉(zhuǎn)杯中加入預冷山梨醇溶液，輕輕吹打混勻后迅速轉(zhuǎn)移到離心管中，放置在30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

31、進一步地，所述s3-2中電擊結(jié)束后立刻往電轉(zhuǎn)杯中加入600-700μl預冷1m山梨醇溶液，輕輕吹打混勻后迅速轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中后放置在30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1-2h。

32、進一步地，所述s3-3中將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細胞p.pastoris?gs115涂布在md平板后倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天。

33、進一步地，所述s3-5中活化重組菌于ypd液體培養(yǎng)基中，30℃，220rpm過夜培養(yǎng)活化。

34、進一步地，所述s3-6中活化的菌液在5ml的bmgy液體培養(yǎng)基中30℃，220rpm培養(yǎng)24h，4℃、5000rpm離心10min收集菌體。

35、進一步地，所述s3-6中使用50ml的bmmy液體培養(yǎng)基懸浮離心收集的菌體并在30℃，220rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)。

36、進一步地，所述s3-7中誘導表達后的培養(yǎng)液在4℃，12000rpm條件下離心10min。

37、本發(fā)明的目的之二在于提供一種高生物活性重組人源ⅹⅶ型膠原蛋白。

38、本發(fā)明的目的之三在于提供一種高生物活性重組人源ⅹⅶ型膠原蛋白在促進組織再生和毛囊修復再生中的應(yīng)用。

39、相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

40、1、xvii型膠原蛋白的胞外域(489-1497aa)中，存在15個膠原域和16個非膠原域，這些結(jié)構(gòu)域共同參與了與細胞外基質(zhì)的相互作用，是參與維持基底膜穩(wěn)定性的重要部分。本發(fā)明對人源xvii型膠原的序列進行設(shè)計與拼接，挑選來源于人全長ⅹⅶ型膠原蛋白α1鏈的胞外域(489-1497aa)中的不同功能域片段拼接得到重組膠原蛋白基因片段(col17a)n，并在重組膠原蛋白前引入來源于不同甲基營養(yǎng)型酵母的直系同源啟動子pichia?pastoris的aox1啟動子或hansenula?polymorpha的fmd啟動子，優(yōu)化合成挑選的(col17a)n、啟動子片段從而構(gòu)建新型重組質(zhì)粒，使其分泌表達的人源xvii型膠原蛋白溶解性更好，生物活性更高，并且穩(wěn)定性更好，顯著降低發(fā)酵后期蛋白降解現(xiàn)象的概率，適合在實際產(chǎn)業(yè)中推廣應(yīng)用，解決了ⅹⅶ型膠原來源受限制的問題。

41、2、不同于現(xiàn)有技術(shù)中常用的大腸桿菌表達系統(tǒng)，本發(fā)明創(chuàng)新性地結(jié)合畢赤酵母表達系統(tǒng)表達與重組質(zhì)粒ppic9k-(col17a)n，分泌表達高生物活性的重組人源ⅹⅶ型膠原蛋白，赤酵母表達系統(tǒng)具備分子伴侶以及蛋白翻譯后修飾的酶(如糖基化、羥基化、乙?；傅?，非常適合具有三螺旋膠原蛋白的人源xvii型膠原蛋白形成，并且克服了大腸桿菌表達系統(tǒng)不能對蛋白質(zhì)進行翻譯后修飾，且可能存在內(nèi)毒素污染和生物學活性較低的缺陷；同時，畢赤酵母表達系統(tǒng)高密度發(fā)酵表達天然序列的重組蛋白質(zhì)時往往被畢赤酵母中的蛋白酶系統(tǒng)降解，本發(fā)明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒ppic9k-(col17a)n分泌的重組人源xvii型膠原蛋白能夠在降低該降解現(xiàn)象的前提下，保持重組人源xvii型膠原蛋白的理化特性，維持生物學功能穩(wěn)定并提高其生物學活性。

42、3、本發(fā)明首次公開了一種高生物活性的重組人源ⅹⅶ型膠原蛋白，所述膠原蛋白具有高級的三螺旋結(jié)構(gòu)以及良好的溶解性，分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，與天然人源ⅹⅶ型膠原蛋白相比，表現(xiàn)出更優(yōu)異的細胞粘附活性、促細胞遷移活性，以及促進組織再生和毛囊修復再生的生物學活性。