本技術(shù)涉及癌癥領(lǐng)域，特別地涉及cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含這樣的cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體(chimeric?antigen?receptor，car)及其使用方法。

背景技術(shù)：

1、癌癥是對人健康最致命的威脅之一。僅在美國，癌癥每年影響接近130萬例新患者，并且其是繼心血管疾病之后第二位的主要死亡原因，其引起約四分之一的死亡。實體瘤是這些死亡中的大多數(shù)的原因。盡管在某些癌癥的醫(yī)學(xué)治療方面已取得顯著進(jìn)步，但在過去的20年內(nèi)所有癌癥的總體5年存活率僅提高約10％。癌癥或惡性腫瘤轉(zhuǎn)移并且以不受控制的方式迅速生長，使得治療極其困難。

2、cd19是85至95kda的跨膜細(xì)胞表面糖蛋白受體。cd19是蛋白質(zhì)的免疫球蛋白(ig)超家族的成員，并且包含兩個胞外ig樣結(jié)構(gòu)域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(tedder?tf,isaacs,cm,1989,jimmunol?143:712-171)。cd19修飾b細(xì)胞受體信號傳導(dǎo)，降低b細(xì)胞受體對抗原的觸發(fā)閾值(carter,rh,and?fearon,dt,1992,science,256:105-107)，并與cd81和cd21協(xié)同以調(diào)節(jié)這一必需的b細(xì)胞信號傳導(dǎo)復(fù)合物(bradbury,le,kansasgs,levy?s,evans?rl,tedder?tf,1992,jimmunol,149:2841-50)。在b細(xì)胞個體發(fā)育(ontogeny)期間cd19能夠獨(dú)立于抗原受體在祖b細(xì)胞(pro-b)、前-前-b細(xì)胞(pre-pre-bcell)、前-b細(xì)胞(pre-b)、早期b細(xì)胞(early?b?cell)階段發(fā)出信號，并且與src家族蛋白酪氨酸激酶相關(guān)，是酪氨酸磷酸化的，誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣調(diào)動(calciummobilization)和肌醇磷脂信號傳導(dǎo)二者(uckun?fm,burkhardt?al,jarvis?l,jun?x,stealy?b,dibirdik?i,myers?de,tuel-ahlgren?l,bolen?jb,1983,j?biol?chem?268:21172-84)。與b細(xì)胞惡性腫瘤的治療相關(guān)的關(guān)鍵點(diǎn)是cd19在正常b細(xì)胞上以嚴(yán)格調(diào)節(jié)的方式表達(dá)，受限于處于igh基因重排階段的早期b細(xì)胞前體、成熟b細(xì)胞，但在造血干細(xì)胞或成熟漿細(xì)胞上不表達(dá)(anderson,kc,bates,mp,slaughenhout?bl,pinkus?gs,schlossman?sf,nadler?lm,1984,blood?63:1424-1433)。

3、目前針對b譜系白血病的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)可由以下組成：通過高劑量的化學(xué)治療或放射的緩解誘導(dǎo)治療，然后進(jìn)行鞏固，以及可根據(jù)需要以干細(xì)胞移植和另外的化學(xué)治療療程為特色(參見在cancer.gov的萬維網(wǎng))。與這些治療相關(guān)的高毒性以及并發(fā)癥的風(fēng)險(例如復(fù)發(fā)、繼發(fā)性惡性腫瘤或gvhd)促使尋求更好的治療替代方案。cd19在成人和兒童(前b-all)b細(xì)胞惡性腫瘤二者上的表達(dá)已導(dǎo)致針對抗體和基于嵌合抗原受體(car)-t細(xì)胞二者的治療均利用該靶標(biāo)(kochenderfer?jn,wilson?wh,janik?je,dudley?me,stetler-stevensonm,feldman?sa,maric?i,raffeld?m,nathan?da,lanier?bj,morgan?ra,rosenberg?sa,2010,blood116:4099-102；lee?dw,kochenderfer?jn,stetler-stevenson?m,cui?yk,delbrook?c,feldman?sa,orentas?r,sabatino?m,shah?nn,steinberg?sm,stroncek?d,tschernia?n,yuan?c,zhang?h,zhang?l,rosenberg?sa,wayne?as,mackall?cl,2015,lancet?385:517-28)。

4、已開發(fā)了許多治療b細(xì)胞白血病和淋巴瘤的新方法，其包括將抗cd19結(jié)合基序與t細(xì)胞結(jié)合基序連接的雙特異性抗體(即博納吐單抗(blinatumomab)，適用于治療費(fèi)城染色體陰性(philadelphia?chromosome-negative)復(fù)發(fā)性或難治性b細(xì)胞前體急性淋巴細(xì)胞白血病(acute?lymphoblastic?leukemia，all)。迄今為止，在car構(gòu)建體中采用的cd19的許多結(jié)合部分利用了來源于鼠抗體的結(jié)構(gòu)域。目前正在考慮批準(zhǔn)這些產(chǎn)品中的許多，包括由novartis和kite?pharmaceuticals所開發(fā)的那些。在2017年4月，novartis宣布ctl019(tisagenlecleucel)獲得了fda突破性認(rèn)定，用于治療患有難治性或復(fù)發(fā)性(r/r)dlbcl(彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤(diffuse?large?b?cell?lymphoma))的兩次或更多次既往治療失敗的成人患者，將該認(rèn)定添加至針對r/r?b細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(all)的認(rèn)定。這些適應(yīng)證分別基于ii期juliet研究(nct02445248)和eliana研究(nct02435849)。juliet試驗示出總響應(yīng)率(overall?response?rate，orr)為45％，其中在三個月時具有37％完全響應(yīng)(complete?response，cr)和8％部分響應(yīng)(partial?response，pr)。在eliana研究中，輸注該產(chǎn)品的患者中82％達(dá)到cr或計數(shù)恢復(fù)不完全的cr，并且在6個月時無復(fù)發(fā)存活率為60％。來自kite?pharmaceuticals的car-t產(chǎn)品(kte-c19，axicabtagene?ciloleucel)針對彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤(dlblc)、轉(zhuǎn)化濾泡性淋巴瘤(transformed?follicular?lymphoma，tfl)和原發(fā)性縱隔b細(xì)胞淋巴瘤(primary?mediastinal?b-cell?lymphoma，pmbcl)被授予突破性認(rèn)定。在kte-c19在r/r?all中的kite?zuma-3ii期試驗中，報告了73％的cr(在2個月或更長時間時)。所有信息均來自公司新聞稿。無論是否利用了car-t治療的抗體，仍有相當(dāng)數(shù)量的患者無法通過這些治療獲得幫助，并且有可觀的空間用于改善的治療方法。

5、嵌合抗原受體(car)是包含以下三個基本單元的雜合分子：(1)胞外抗原結(jié)合基序、(2)連接/跨膜基序，以及(3)胞內(nèi)t細(xì)胞信號傳導(dǎo)基序(long?ah,haso?wm,orentasrj.lessons?learned?from?a?highly-active?cd22-specific?chimeric?antigenreceptor.oncoimmunology.2013；2(4):e23621)。car的抗原結(jié)合基序通常仿效免疫球蛋白(ig)分子的最小結(jié)合結(jié)構(gòu)域，單鏈可變片段(single?chain?fragment?variable，scfv)。還已改造了替選的抗原結(jié)合基序，例如受體配體(即，已將il-13改造成結(jié)合腫瘤表達(dá)的il-13受體)、完整免疫受體、文庫來源肽和固有免疫系統(tǒng)效應(yīng)分子(例如nkg2d)。用于car表達(dá)的替選細(xì)胞靶標(biāo)(例如nk或γ-δt細(xì)胞)也在開發(fā)之中(brown?ce?et?al?clin?cancerres.2012；18(8):2199–209；lehner?m?et?al.plos?one.2012；7(2):e31210)。關(guān)于限定最活躍的t細(xì)胞群以用car載體進(jìn)行傳導(dǎo)、確定最佳的培養(yǎng)和擴(kuò)增技術(shù)，以及限定car蛋白結(jié)構(gòu)本身的分子細(xì)節(jié)，仍有大量工作有待完成。

6、car的連接基序可以是相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域(例如igg的恒定結(jié)構(gòu)域)或被設(shè)計成延伸的柔性接頭。結(jié)構(gòu)基序(例如來源于igg恒定結(jié)構(gòu)域的那些)可用于將scfv結(jié)合結(jié)構(gòu)域延伸遠(yuǎn)離t細(xì)胞質(zhì)膜表面。這對于一些其中結(jié)合結(jié)構(gòu)域與腫瘤細(xì)胞表面膜特別接近的腫瘤靶標(biāo)而言可以是重要的(例如對于二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂gd2而言；orentas?et?al.，未發(fā)表的觀察結(jié)果)。迄今為止，用于car的信號傳導(dǎo)基序總是包含cd3-ζ鏈，因為該核心基序是t細(xì)胞活化的關(guān)鍵信號。首次報道的第二代car以cd28信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和cd28跨膜序列為特征。該基序還用于包含cd137(4-1bb)信號傳導(dǎo)基序的第三代car中(zhao?y?et?al?jimmunol.2009；183(9):5563–74)。隨著新技術(shù)的出現(xiàn)，用與抗cd3和抗cd28抗體連接的珠活化t細(xì)胞，以及來自cd28的典型“信號2”的存在不再需要由car自身編碼。通過使用珠活化，發(fā)現(xiàn)在體外測定中第三代載體并不優(yōu)于第二代載體，并且在白血病的小鼠模型中其相對于第二代載體并未提供明顯的益處(haso?w,lee?dw,shah?nn,stetler-stevenson?m,yuancm,pastan?ih,dimitrov?ds,morgan?ra,fitzgerald?dj,barrett?dm,wayne?as,mackallcl,orentas?rj.anti-cd22-chimeric?antigen?receptors?targeting?bcell?precursoracute?lymphoblastic?leukemia,blood.2013；121(7):1165–74；kochenderfer?jn?etal.blood.2012；119(12):2709–20)。這通過第二代cd28/cd3-ζ(lee?dw?et?al.americansociety?ofhematology?annual?meeting.new?orleans,la；december?7-10,2013)和cd137/cd3-ζ信號傳導(dǎo)形式(porter?dlet?al.n?engl?j?med.2011；365(8):725–33)的cd19特異性car的臨床成功得到證實。除cd137之外，其他腫瘤壞死因子受體超家族成員(例如ox40)也能夠在car轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞中提供重要的持續(xù)信號(yvon?e?et?al.clin?cancerres.2009；15(18):5852–60)。同樣重要的是培養(yǎng)car?t細(xì)胞群的培養(yǎng)條件，例如包含細(xì)胞因子il-2、il-7和/或il-15(kaiser?ad?et?al.cancer?gene?ther.2015；22(2):72-78)。

7、目前用于癌癥的car治療的更廣泛且有效的適應(yīng)中的挑戰(zhàn)與有力靶標(biāo)的缺乏相關(guān)。建立細(xì)胞表面抗原的結(jié)合物現(xiàn)今是可容易實現(xiàn)的，但發(fā)現(xiàn)對腫瘤具有特異性同時不傷害正常組織的細(xì)胞表面抗原仍然是艱巨的挑戰(zhàn)。賦予car表達(dá)t細(xì)胞以更大靶細(xì)胞特異性的一種潛在方式是使用組合的car方法。在一種系統(tǒng)中，將cd3-ζ和cd28信號單元在同一細(xì)胞中表達(dá)的兩種不同car構(gòu)建體之間分開；在另一種系統(tǒng)中，在同一t細(xì)胞中表達(dá)兩種car，但一種具有較低的親和力并因此需要另一種car首先進(jìn)行接合(engage)以使第二者具有完全活性(lanitis?e?et?al.cancer?immunol?res.2013；1(1):43–53；kloss?cc?et?al.natbiotechnol.2013；31(1):71–5)。產(chǎn)生基于單scfv的car作為免疫治療劑的第二挑戰(zhàn)是腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性。至少一個團(tuán)隊已開發(fā)了用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的car策略，其中效應(yīng)細(xì)胞群同時靶向多種抗原(her2、il-13ra、epha2)，希望避免靶抗原陰性群的結(jié)果(hegde?m?et?al.molther.2013；21(11):2087–101)。

8、基于t細(xì)胞的免疫治療已經(jīng)成為合成生物學(xué)中的新前沿；預(yù)見多種啟動子和基因產(chǎn)物將這些高度強(qiáng)效的細(xì)胞引導(dǎo)至腫瘤微環(huán)境，在此t細(xì)胞不但可以避開負(fù)調(diào)節(jié)信號而且還可以介導(dǎo)有效的腫瘤殺傷。通過用基于化學(xué)的二聚體(例如ap1903)進(jìn)行誘導(dǎo)型胱天蛋白酶9(caspase?9)構(gòu)建體的藥物誘導(dǎo)二聚化來消除不期望的t細(xì)胞，表明其中可在藥理學(xué)上開啟可控制t細(xì)胞群的強(qiáng)大開關(guān)的一種方式(di?stasi?aet?al.n?engl?j?med.2011；365(18):1673–83)。通過誘餌受體的表達(dá)產(chǎn)生對轉(zhuǎn)化生長因子β的負(fù)調(diào)節(jié)效應(yīng)具有免疫的效應(yīng)t細(xì)胞群進(jìn)一步表明針對最佳抗腫瘤活性可對效應(yīng)t細(xì)胞進(jìn)行改造的程度(foster?ae?etal.j?immunother.2008；31(5):500–5)。因此，雖然看起來car可以以類似于內(nèi)源性t細(xì)胞受體的方式觸發(fā)t細(xì)胞活化，但迄今為止該技術(shù)的臨床應(yīng)用的主要障礙受限于car+t細(xì)胞的體內(nèi)擴(kuò)增、輸注之后細(xì)胞的迅速消失和令人失望的臨床活性。這可部分地歸因于所采用的一些car序列的鼠來源。

9、對于接受該治療的重癥患者，使用博納吐單抗(blinotumomab)(雙特異性抗cd19和抗cd3抗體)已顯示出令人印象深刻的結(jié)果。然而持久緩解率小于40％，并且最多只有50％的應(yīng)答者可被造血干細(xì)胞移植(hematopoietic?stem?cell?transplant，hsct)挽救(參見gore?et?al.,2014,nct01471782和von?stackelberg,et?al.,2014,nct01471782，在benjamin,je,stein?as,2016,therapeutic?advances?in?hematology?7:142-156中進(jìn)行了概述)。已接受雙特異性抗體或car-t治療的患者隨后進(jìn)行hsct以維持持久應(yīng)答的要求仍是積極爭論的領(lǐng)域。盡管報道了cd19?car-t試驗的高度響應(yīng)，一些甚至大于90％，但如果將試驗重塑為“意圖治療”試驗，則該數(shù)字可更接近70％(davis?kl,mackall?cl,2016,bloodadvances1:265-268)。報道的在car19治療之后12個月的最佳結(jié)果顯示，在賓夕法尼亞大學(xué)(the?university?of?pennsylvania)能夠接受t細(xì)胞產(chǎn)品的患者中，rfs為55％并且os為79％(maude?sl,teachey?dt,rheingold?sr,shaw?pa,aplenc?r,barrett?dm,barker?cs,callahan?c,frey?nv,farzana?n,lacey?sf,zheng?a,levine?b,melenhorst?jj,motleyl,prter?dl,june?ch,grupp?sa,2016,j?clin?oncol?34,no15_suppl(may?2016)3011-3011)。

10、因此，本領(lǐng)域中迫切且長期需要找到使用可表現(xiàn)出特異性和有效抗腫瘤作用而沒有前述缺點(diǎn)的方法用于治療b-all和其他表達(dá)cd19的b細(xì)胞惡性腫瘤的新的組合物和方法。

11、本發(fā)明通過提供可用于治療癌癥和其他疾病和/或病癥的car組合物和治療方法而解決了這些需求。特別地，如本文中所公開和描述的本發(fā)明提供了以下car：其可用于治療與cd19表達(dá)失調(diào)相關(guān)的疾病、障礙或病癥，并且所述car包含cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其在經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞上表現(xiàn)出高表面表達(dá)、表現(xiàn)出表達(dá)cd19細(xì)胞的高度細(xì)胞裂解，并且其中經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞示出體內(nèi)擴(kuò)增和持續(xù)性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本文中提供了包含這樣的cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的新的抗cd19抗體或其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及嵌合抗原受體(car)，以及表達(dá)所述受體的宿主細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)，以及編碼所述受體的核酸分子。所述car在經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞上表現(xiàn)出高表面表達(dá)，并且在體內(nèi)具有高度的細(xì)胞裂解以及經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞擴(kuò)增和持續(xù)性。還提供了使用所公開的car、宿主細(xì)胞和核酸分子的方法，例如以在對象中治療癌癥。

2、因此，在一方面中，提供了編碼人抗cd19抗體或其片段的分離的多核苷酸，其包含選自seq?id?no:1、3、5、7、9、11、13和15的核酸序列。

3、在一個實施方案中，提供了編碼完全人抗cd19抗體或其片段的分離的多核苷酸，其中所述抗體或其片段包含選自fab片段、f(ab’)2片段、fv片段和單鏈fv(scfv)的片段。

4、在一個實施方案中，提供了編碼完全人抗cd19抗體或其片段的分離的多核苷酸，其中所述抗體或其片段包含選自seq?id?no:2、4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列。

5、在一方面中，提供了編碼嵌合抗原受體(car)的分離的核酸分子，所述嵌合抗原受體從n端到c端包含至少一個cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、至少一個跨膜結(jié)構(gòu)域和至少一個胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域由包含選自seq?id?no:1、3、5、7、9、11、13和15的核酸序列的核苷酸序列編碼。

6、在一個實施方案中，提供了編碼car的分離的核酸分子，其中所編碼的胞外cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含與cd19結(jié)合的抗體的至少一個單鏈可變片段。

7、在另一個實施方案中，提供了編碼car的分離的核酸分子，其中所編碼的胞外cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含與cd19結(jié)合的抗體的至少一個重鏈可變區(qū)。

8、在另一個實施方案中，提供了編碼car的分離的核酸分子，其中所編碼的car胞外cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域還包含至少一個與cd19結(jié)合的基于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(lipocalin)的抗原結(jié)合抗原(抗運(yùn)載蛋白(anticalin))。

9、在一個實施方案中，提供了分離的核酸分子，其中所編碼的胞外cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過接頭結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域連接。

10、在另一個實施方案中，提供了編碼car的分離的核酸分子，其中在編碼的cd19胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域之前是編碼前導(dǎo)或信號肽的序列。

11、在另一個實施方案中，提供了編碼car的分離的核酸分子，所述car包含由含有選自seq?id?no:1、3、5、7、9、11、13和15的核酸序列的核苷酸序列編碼的至少一個cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且其中car另外編碼靶向包括但不限于以下抗原的胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域：cd20、cd22、ror1、間皮素、cd33、cd38、cd123(il3ra)、cd138、bcma(cd269)、gpc2、gpc3、fgfr4、c-met、psma、糖脂f77、egfrviii、gd-2、tslpr、ny-eso-1tcr、mage?a3?tcr，或其任意組合。

12、在某些實施方案中，提供了編碼car的分離的核酸分子，其中另外的所編碼的胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含抗cd20?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗cd22?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗ror1scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗間皮素scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗cd33?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗cd38?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗cd123(il3ra)scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗cd138?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗bcma(cd269)scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗gpc2?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗gpc3?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗fgfr4?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗tslpr?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗c-metscfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗pmsascfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗糖脂f77?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗egfrviii?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗gd-2scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗ny-eso-1tcr?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗mage?a3?tcr?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或與其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意組合。

13、在一方面中，本文中提供的car還包含接頭或間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域(spacer?domain)。

14、在一個實施方案中，提供了編碼car的分離的核酸分子，其中所述胞外cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或這二者通過接頭或間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域與所述跨膜結(jié)構(gòu)域連接。

15、在一個實施方案中，提供了編碼car的分離的核酸分子，其中所編碼的接頭結(jié)構(gòu)域來源于cd8或cd28的胞外結(jié)構(gòu)域，并且與跨膜結(jié)構(gòu)域連接。

16、在另一個實施方案中，提供了編碼car的分離的核酸分子，其中所編碼的car還包含跨膜結(jié)構(gòu)域，所述跨膜結(jié)構(gòu)域包含選自以下的蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域：t細(xì)胞受體的α、β或ζ鏈；cd28；cd3ε；cd45；cd4；cd5；cd8；cd9；cd16；cd22；cd33；cd37；cd64；cd80；cd83；cd86；cd134；cd137和cd154；或其組合。

17、在另一個實施方案中，提供了編碼car的分離的核酸分子，其中所編碼的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域還包含cd3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。

18、在一個實施方案中，提供了編碼car的分離的核酸分子，其中所編碼的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域相對于cd3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域布置在n端側(cè)。

19、在另一個實施方案中，提供了編碼car的分離的核酸分子，其中所編碼的至少一個胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含共刺激結(jié)構(gòu)域、初級信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(primary?signalingdomain)，或其組合。

20、在另一些實施方案中，提供了編碼car的分離的核酸分子，其中所編碼的至少一個共刺激結(jié)構(gòu)域包含以下的功能性信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域：ox40、cd70、cd27、cd28、cd5、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、dap10、dap12和4-1bb(cd137)，或其組合。

21、在一個實施方案中，提供了編碼car的分離的核酸分子，其還包含前導(dǎo)序列或信號肽，其中前導(dǎo)或信號肽核苷酸序列包含seq?id?no:17的核苷酸序列。

22、在另一個實施方案中，提供了編碼car的分離的核酸分子，其中所編碼的前導(dǎo)序列包含seq?id?no:18的氨基酸序列。

23、在一方面中，本文中提供了嵌合抗原受體(car)，其從n端到c端包含至少一個cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、至少一個跨膜結(jié)構(gòu)域和至少一個胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

24、在一個實施方案中，提供了car，其中所述胞外cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含與抗原結(jié)合的抗體的至少一個單鏈可變片段、或與抗原結(jié)合的抗體的至少一個重鏈可變區(qū)，或其組合。

25、在另一個實施方案中，提供了car，其中所述至少一個跨膜結(jié)構(gòu)域包含選自以下的蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域：t細(xì)胞受體的α、β或ζ鏈；cd28；cd3ε；cd45；cd4；cd5；cd8；cd9；cd16；cd22；cd33；cd37；cd64；cd80；cd86；cd134；cd137；cd154；tnfrsf19；或其組合。

26、在一些實施方案中，提供了car，其中car另外編碼包含以下的胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域：cd20、cd22、ror1、間皮素、cd33、cd38、cd123(il3ra)、cd138、bcma(cd269)、gpc2、gpc3、fgfr4、tslpr、c-met、psma、糖脂f77、egfrviii、gd-2、tslpr、ny-eso-1tcr、mage?a3?tcr，或與其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意組合。

27、在一個實施方案中，提供了car，其中所述胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含抗cd20?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗cd22?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗ror1scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗間皮素scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗cd33?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗cd38?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗cd123(il3ra)scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗cd138?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗bcma(cd269)scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗gpc2?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗gpc3?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗fgfr4?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗tslpr?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗c-met?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗pmsascfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗糖脂f77?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗egfrviii?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗gd-2scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗ny-eso-1tcr?scfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗mage?a3?tcrscfv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或與其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意組合。

28、在另一個實施方案中，提供了car，其中至少一個胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含共刺激結(jié)構(gòu)域和初級信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

29、在另一個實施方案中，提供了car，其中至少一個胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含共刺激結(jié)構(gòu)域，所述共刺激結(jié)構(gòu)域包含選自以下的蛋白質(zhì)的功能性信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域：ox40、cd70、cd27、cd28、cd5、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、dap10、dap12和4-1bb(cd137)，或其組合。

30、在一個實施方案中，編碼car的核酸序列包含seq?id?no:19的核酸序列(ltg2050lp-m19217-cd8?tm-41bb-cd3ζcar核酸序列(圖2a))。在一個實施方案中，該核酸序列編碼包含seq?id?no:20的氨基酸序列(ltg?2050lp-m19217-cd8?tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(圖2a))的car。

31、在另一個實施方案中，編碼car的核酸序列包含seq?id?no:21的核酸序列(ltg2065lp-m19217-1-cd8?tm-41bb-cd3ζcar核酸序列(圖2b))。在一個實施方案中，該核酸序列編碼包含seq?id?no:22的氨基酸序列(ltg?2065lp-m19217-1-cd8?tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(圖2b))的car。

32、在另一個實施方案中，編碼car的核酸序列包含seq?id?no:23的核酸序列(ltg2066?lp-m19217-2-cd8?tm-41bb-cd3ζcar核苷酸序列(圖2c))。在一個實施方案中，該核酸序列編碼包含seq?id?no:24的氨基酸序列(ltg?2066lp-m19217-2-cd8?tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(圖2c))的car。

33、在另一個實施方案中，編碼car的核酸序列包含seq?id?no:25的核酸序列(ltg2067lp-m19217-7-cd8?tm-41bb-cd3ζcar核酸序列(圖2d))。在一個實施方案中，該核酸序列編碼包含seq?id?no:26的氨基酸序列(ltg?2067lp-m19217-7-cd8?tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(圖2d))的car。

34、在另一個實施方案中，編碼car的核酸序列包含seq?id?no:27的核酸序列(ltg2068lp-m19217-23-cd8?tm-41bb-cd3ζcar核酸序列(圖2e))。在一個實施方案中，該核酸序列編碼包含seq?id?no:28的氨基酸序列(ltg2068?lp-m19217-23-cd8?tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(圖2e))的car。

35、在另一個實施方案中，編碼car的核酸序列包含seq?id?no:29的核酸序列(ltg2069lp-m19217-29-cd8?tm-41bb-cd3ζcar核酸序列(圖2f))。在一個實施方案中，該核酸序列編碼包含seq?id?no:30的氨基酸序列(ltg?2069lp-m19217-29-cd8?tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(圖2f))的car。

36、在另一個實施方案中，編碼car的核酸序列包含seq?id?no:31的核酸序列(ltg2070lp-m19217-38-cd8?tm-41bb-cd3ζcar核酸序列(圖2g))。在一個實施方案中，該核酸序列編碼包含seq?id?no:32的氨基酸序列(ltg?2070lp-m19217-38-cd8?tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(圖2g))的car。

37、在另一個實施方案中，編碼car的核酸序列包含seq?id?no:33的核酸序列(ltg2071lp-m19217-40-cd8?tm-41bb-cd3ζcar核酸序列(圖2h))。在一個實施方案中，該核酸序列編碼包含seq?id?no:34的氨基酸序列(ltg?2071lp-m19217-40-cd8?tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(圖2h))的car。

38、在一方面中，本文中所公開的car被修飾以表達(dá)或包含可檢測標(biāo)志物，以用于診斷、監(jiān)測、和/或預(yù)測治療結(jié)果(例如癌癥患者的無進(jìn)展存活)或用于監(jiān)測這樣的治療的進(jìn)展。

39、在一個實施方案中，編碼所公開car的核酸分子可包含在載體(例如病毒載體)中。載體是dna載體、rna載體、質(zhì)粒載體、黏粒載體、皰疹病毒載體、麻疹病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，或其組合。

40、在某些實施方案中，所述載體還包含啟動子，其中所述啟動子是誘導(dǎo)型啟動子、組織特異性啟動子、組成型啟動子、自殺型啟動子或其任意組合。

41、在另一個實施方案中，表達(dá)car的載體還可被修飾以包含一個或更多個控制car?t細(xì)胞表達(dá)或借助自殺開關(guān)來消除car-t細(xì)胞的操縱元件。自殺開關(guān)可包括例如凋亡誘導(dǎo)性信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的藥物。在一個優(yōu)選實施方案中，表達(dá)car的載體還可被修飾以表達(dá)酶，例如胸苷激酶(thymidine?kinase，tk)或胞嘧啶脫氨酶(cytosinedeaminase，cd)。

42、在另一方面中，還提供了包含編碼car的核酸分子的宿主細(xì)胞。在一些實施方案中，所述宿主細(xì)胞是t細(xì)胞，例如從對象中獲得的原代t細(xì)胞。在一個實施方案中，所述宿主細(xì)胞是cd8+t細(xì)胞。

43、在另一方面中，提供了包含抗腫瘤有效量的人t細(xì)胞群的藥物組合物，其中所述t細(xì)胞包含編碼嵌合抗原受體(car)的核酸序列，其中所述car包含至少一個胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、至少一個接頭結(jié)構(gòu)域、至少一個跨膜結(jié)構(gòu)域和至少一個胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含含有seq?id?no.2、4、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列的人cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述t細(xì)胞是患有癌癥的人的t細(xì)胞。所述癌癥尤其包括血液系統(tǒng)癌癥(hematological?cancer)，例如白血病(例如慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic?lymphocyticleukemia，cll)、急性淋巴細(xì)胞白血病(acute?lymphocytic?leukemia，all)或慢性髓細(xì)胞性白血病(chronic?myelogenous?leukemia，cml)、淋巴瘤(例如，套細(xì)胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin's?lymphoma)或霍奇金淋巴瘤(hodgkin'slymphoma))或多發(fā)性骨髓瘤，或其組合。

44、在一個實施方案中，提供了藥物組合物，其中car的至少一個跨膜結(jié)構(gòu)域包含選自以下的蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域：t細(xì)胞受體的α、β或ζ鏈；cd28；cd3ε；cd45；cd4；cd5；cd8；cd9；cd16；cd22；間皮素；cd33；cd37；cd64；cd80；cd83；cd86；cd134；cd137；cd154；tnfrsf19；或其組合。

45、在另一個實施方案中，提供了藥物組合物，其中人癌癥包括成人癌(adultcarcinoma)，其包括口腔和咽癌(舌、口、咽、頭和頸)、消化系統(tǒng)癌癥(食管、胃、小腸、結(jié)腸、直腸、肛門、肝、肝內(nèi)膽管、膽囊、胰腺)、呼吸系統(tǒng)癌癥(喉、肺和支氣管)、骨和關(guān)節(jié)癌、軟組織癌、皮膚癌(黑素瘤、基底細(xì)胞和鱗狀細(xì)胞癌)、兒童腫瘤(神經(jīng)母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤(ewing’s?sarcoma))、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤(腦、星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤)，以及乳腺癌、生殖系統(tǒng)癌癥(子宮頸、子宮體、卵巢、外陰、陰道、前列腺、睪丸、陰莖、子宮內(nèi)膜)、泌尿系統(tǒng)癌癥(膀胱、腎和腎盂、輸尿管)、眼癌和眶(orbit)癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌癥(甲狀腺)，以及腦癌和其他神經(jīng)系統(tǒng)癌癥，或其任意組合。

46、在另一個實施方案中，提供了包含抗腫瘤有效量的患有癌癥之人的人t細(xì)胞群的藥物組合物，其中所述癌癥是對一種或更多種化學(xué)治療劑不具有響應(yīng)性的難治性癌癥。所述癌癥包括造血系統(tǒng)癌癥、骨髓增生異常綜合征胰腺癌、頭頸癌、皮膚腫瘤、以下中的微小殘留病(minimal?residual?disease，mrd)：急性淋巴細(xì)胞白血病(all)、急性髓細(xì)胞性白血病(acute?myeloid?leukemia，aml)、成人b細(xì)胞惡性腫瘤(包括cll(慢性淋巴細(xì)胞白血病)、cml(慢性髓細(xì)胞性白血病)、非霍奇金淋巴瘤(nhl))、兒童b細(xì)胞惡性腫瘤(包括b譜系all(急性淋巴細(xì)胞白血病))、多發(fā)性骨髓瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤或其他血液系統(tǒng)癌癥和實體瘤，或其任意組合。

47、在另一方面中，提供了制備包含car的t細(xì)胞(下文中“car-t細(xì)胞”)的方法。所述方法包括用編碼特異性結(jié)合cd19的所公開car的載體或核酸分子轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞，從而制備car-t細(xì)胞。

48、在另一方面中，提供了產(chǎn)生rna經(jīng)改造的細(xì)胞群的方法，其包括將編碼所公開的car的核酸分子的體外轉(zhuǎn)錄rna或合成rna引入對象的細(xì)胞內(nèi)，從而產(chǎn)生表達(dá)car的細(xì)胞。

49、在另一方面中，提供了用于診斷與細(xì)胞上cd19表達(dá)相關(guān)的疾病、障礙或病癥的方法，其包括a)使細(xì)胞與人抗cd19抗體或其片段接觸，其中所述抗體或其片段包含選自seqid?no:2、4、6、8、10、12、14、16的氨基酸序列；以及b)檢測cd19的存在，其中cd19的存在診斷與cd19表達(dá)相關(guān)的疾病、障礙或病癥。

50、在一個實施方案中，與cd19表達(dá)相關(guān)的疾病、障礙或病癥是癌癥，其包括造血系統(tǒng)癌癥、骨髓增生異常綜合征胰腺癌、頭頸癌、皮膚腫瘤、以下中的微小殘留病(minimalresidual?disease，mrd)：急性淋巴細(xì)胞白血病(all)、急性髓細(xì)胞性白血病(aml)、成人b細(xì)胞惡性腫瘤(包括cll(慢性淋巴細(xì)胞白血病)、cml(慢性髓細(xì)胞性白血病)、非霍奇金淋巴瘤(nhl))、兒童b細(xì)胞惡性腫瘤(包括b譜系all(急性淋巴細(xì)胞白血病))、多發(fā)性骨髓瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤或其他血液系統(tǒng)癌癥和實體瘤，或其任意組合。

51、在另一個實施方案中，提供了診斷、預(yù)后或確定哺乳動物中與cd19相關(guān)疾病風(fēng)險的方法，其包括檢測來源于哺乳動物的樣品中cd19的表達(dá)，包括：a)使樣品與人抗cd19抗體或其片段接觸，其中所述抗體或其片段包含選自seq?id?no:2、4、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列；以及b)檢測cd19的存在，其中cd19的存在診斷哺乳動物中與cd19相關(guān)疾病。

52、在另一個實施方案中，提供了抑制cd19依賴性t細(xì)胞抑制的方法，其包括使細(xì)胞與人抗cd19抗體或其片段接觸，其中所述抗體或其片段包含選自seq?id?no:2、4、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列。在一個實施方案中，細(xì)胞選自表達(dá)cd19的腫瘤細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，及其任意組合。

53、在另一個實施方案中，提供了阻斷由表達(dá)cd19的細(xì)胞介導(dǎo)的t細(xì)胞抑制和改變腫瘤微環(huán)境以抑制哺乳動物中的腫瘤生長的方法，其包括向哺乳動物施用有效量的包含分離的抗cd19抗體或其片段的組合物，其中所述抗體或其片段包含選自seq?id?no:2、4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述細(xì)胞選自表達(dá)cd19的腫瘤細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，及其任意組合。

54、在另一個實施方案中，提供了抑制、阻止或預(yù)防哺乳動物中抗腫瘤或抗癌免疫應(yīng)答的免疫抑制的方法，其包括向哺乳動物施用有效量的包含分離的抗cd19抗體或其片段的組合物，其中所述抗體或其片段包含選自seq?id?no:2、4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述抗體或其片段抑制第一細(xì)胞與t細(xì)胞之間的相互作用，其中所述第一細(xì)胞選自表達(dá)cd19的腫瘤細(xì)胞，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，及其任意組合。

55、在另一方面中，提供了用于在哺乳動物中誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，其包括向哺乳動物施用治療有效量的用編碼所公開的car的載體或核酸分子轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞。

56、在另一個實施方案中，提供了在哺乳動物中治療或預(yù)防癌癥的方法，其包括以在哺乳動物中有效治療或預(yù)防癌癥的量向哺乳動物施用一種或更多種所公開的car。該方法包括在以下條件下向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康谋磉_(dá)特異性結(jié)合cd19和/或前述一種或更多種抗原的所公開的car的宿主細(xì)胞，所述條件足以在所述對象中使得car上的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與cd19和/或前述一種或更多種抗原的胞外結(jié)構(gòu)域形成免疫復(fù)合物。

57、在另一個實施方案中，提供了用于治療患有與腫瘤抗原表達(dá)升高相關(guān)的疾病、障礙或病癥的哺乳動物的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯冒鼓[瘤有效量的t細(xì)胞群的藥物組合物，其中所述t細(xì)胞包含編碼嵌合抗原受體(car)的核酸序列，其中所述car包含至少一個胞外cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、至少一個接頭或間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域、至少一個跨膜結(jié)構(gòu)域、至少一個胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述胞外cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含seq?idno.2、4、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列，或其任意組合，并且其中所述t細(xì)胞是患有癌癥的對象的t細(xì)胞。

58、在另一個實施方案中，提供了用于在有此需要的對象中治療癌癥的方法，其包括向所述對象施用包含抗腫瘤有效量的t細(xì)胞群的藥物組合物，其中所述t細(xì)胞包含編碼嵌合抗原受體(car)的核酸序列，其中所述car包含至少一個cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、至少一個接頭或間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域、至少一個跨膜結(jié)構(gòu)域、至少一個胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含seq?id?no.2、4、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列，或其任意組合，其中所述t細(xì)胞是患有癌癥的對象的t細(xì)胞。在前述方法的一些實施方案中，所述至少一個跨膜結(jié)構(gòu)域包含選自以下的蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域：t細(xì)胞受體的α、β或ζ鏈；cd28；cd3ε；cd45；cd4；cd5；cd8；cd9；cd16；cd19；cd22；間皮素；cd33；cd37；cd64；cd80；cd83；cd86；cd134；cd137；cd154；tnfrsf16；tnfrsf19；或其組合。

59、在另一個實施方案中，提供了用于在被診斷患有癌癥的人中產(chǎn)生持續(xù)性經(jīng)遺傳改造t細(xì)胞群的方法。在一個實施方案中，所述方法包括向人施用經(jīng)遺傳改造為表達(dá)car的t細(xì)胞，其中所述car包含至少一個cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、至少一個跨膜結(jié)構(gòu)域和至少一個胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述cd19抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含seq?id?no.2、4、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列，或其任意組合，其中在施用之后，所述持續(xù)性經(jīng)遺傳改造t細(xì)胞群或所述t細(xì)胞的子代群在人體內(nèi)持續(xù)存在至少1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、2年或3年。

60、在一個實施方案中，人中的子代t細(xì)胞包含記憶t細(xì)胞。在另一個實施方案中，t細(xì)胞是自體t細(xì)胞。

61、在本文中所述的所有方法的方面和實施方案中，均可使用本文中所公開的一種或更多種car來治療或預(yù)防或改善與腫瘤抗原的表達(dá)升高相關(guān)的任何前述癌癥、疾病、障礙或病癥。

62、在另一方面中，提供了用于制備如上所述的嵌合抗原受體t細(xì)胞或用于如上所述在對象中預(yù)防、治療或改善任何與腫瘤抗原表達(dá)升高相關(guān)的癌癥、疾病、障礙或病癥的藥盒(kit)，其包含容器和用于使用該藥盒的說明書，所述容器包含上文中所公開的核酸分子、載體、宿主細(xì)胞或組合物的任一種或其任意組合。

63、應(yīng)理解，car、宿主細(xì)胞、核酸和方法在本文中詳細(xì)描述的特定方面和實施方案之外也是可用的。本公開內(nèi)容的前述特征和優(yōu)點(diǎn)將從以下詳細(xì)描述變得更明顯，該詳細(xì)描述通過參考附圖來進(jìn)行。