本發(fā)明涉及熒光探針，具體涉及一種高信噪比檢測(cè)生物體內(nèi)、體外線粒體粘度變化熒光探針的開發(fā)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、線粒體的代謝穩(wěn)態(tài)是真核細(xì)胞維持正常功能的必要條件。當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)大并最終分裂時(shí)，它們需要更多的“燃料”，因此需要更多的線粒體。線粒體作為維持組織穩(wěn)態(tài)不可缺少的能量發(fā)生器和程序性細(xì)胞凋亡的途徑，其核心功能也要求對(duì)其質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行嚴(yán)格控制。在用于評(píng)估線粒體的眾多指標(biāo)中，粘度成為關(guān)鍵參數(shù)，線粒體粘度是各種物種在線粒體內(nèi)擴(kuò)散速率的指標(biāo)。此外，多種活性大分子的生物動(dòng)力學(xué)，如蛋白質(zhì)折疊、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和酶催化，通常在正常條件下保持穩(wěn)定的粘度變化。因此，線粒體粘度的變化可以為了解這些細(xì)胞器的狀態(tài)和功能提供線索。相反，線粒體粘度的異常變化可能會(huì)破壞細(xì)胞功能，導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。因此，實(shí)時(shí)跟蹤和監(jiān)測(cè)線粒體粘度變化對(duì)于研究和診斷與線粒體粘度相關(guān)的疾病是必要的。然而，在這一過程中，缺乏成熟的技術(shù)和手段是一個(gè)持續(xù)的挑戰(zhàn)。

2、熒光探針的熒光顯微成像技術(shù)被認(rèn)為是生物傳感中最具吸引力的方法之一，它可以在細(xì)胞和生物水平上實(shí)時(shí)顯示信息。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，如化學(xué)發(fā)光、電分析、拉曼光譜等，受到樣品結(jié)構(gòu)復(fù)雜、儀器昂貴和實(shí)時(shí)分析信號(hào)困難的限制。相比之下，熒光顯微成像技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、時(shí)空分辨率高、實(shí)時(shí)原位成像能力強(qiáng)等特點(diǎn)。與熒光壽命顯微鏡、超分辨率熒光顯微鏡和雙光子成像顯微鏡合作，可以更方便地對(duì)生物體中相關(guān)分子進(jìn)行無損檢測(cè)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

3、線粒體粘度的變化通常與腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化和其他疾病密切相關(guān)，近年來，許多熒光探針被開發(fā)用于檢測(cè)與疾病相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)線粒體粘度。盡管探針在反饋細(xì)胞內(nèi)線粒體粘度的變化方面取得了一些進(jìn)展，但對(duì)于生物體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下的粘度變化卻未能得到詳盡的研究。

4、因此，為了解決上述問題，需要研發(fā)一種高信噪比熒光探針，用于觀察不同條件下線粒體在細(xì)胞內(nèi)和生物體內(nèi)的粘度變化，并觀察線粒體在原位的動(dòng)態(tài)過程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種高信噪比檢測(cè)生物體內(nèi)、體外線粒體粘度變化熒光探針的開發(fā)及其應(yīng)用。本發(fā)明制得的高信噪比的線粒體粘度響應(yīng)熒光探針的化學(xué)名稱為(e)-5.6-二氯-1,3-二乙基-2-(2-(8-羥基久洛尼啶-9-乙烯基)-苯并咪唑-3-碘化鎓，簡(jiǎn)稱jl-jc。其可染色體外活細(xì)胞中的線粒體，且在優(yōu)異光穩(wěn)定性的前提下可以原位監(jiān)測(cè)線粒體的斷裂、融合，能夠靈敏反饋由于藥物誘導(dǎo)和環(huán)境變化導(dǎo)致的活細(xì)胞內(nèi)線粒體粘度變化，同時(shí)，所述熒光探針還制備用于生物體內(nèi)線粒體染色的產(chǎn)品和監(jiān)測(cè)生物體體內(nèi)的線粒體粘度變化的產(chǎn)品。受分子結(jié)構(gòu)的影響，所述熒光探針對(duì)生物體內(nèi)、體外的環(huán)境粘度有敏感響應(yīng)，具有優(yōu)于商品化線粒體探針的信噪比。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的第一方面，提供了一種高信噪比的線粒體粘度響應(yīng)熒光探針，所述熒光探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(i)所示：

4、

5、所述熒光探針的化學(xué)名稱為：(e)-5.6-二氯-1,3-二乙基-2-(2-(8-羥基久洛尼啶-9-乙烯基)-苯并咪唑-3-碘化鎓，簡(jiǎn)稱jl-jc。

6、優(yōu)選的，所述熒光探針的最大吸收波長范圍為470-500nm，最大發(fā)射波長在560-580nm。

7、所述熒光探針對(duì)環(huán)境粘度表現(xiàn)出敏感的響應(yīng)，在溶液測(cè)試中熒光發(fā)射強(qiáng)度有數(shù)十倍增加。熒光探針分子具有陽離子鹽結(jié)構(gòu)，能夠通過靜電相互作用快速靶向活細(xì)胞中的線粒體，熒光探針分子相比于商用線粒體探針具有更高的信噪比，能夠更清晰的成像活細(xì)胞中的線粒體。此外，熒光探針能夠正確反饋體外活細(xì)胞中和生命體體內(nèi)線粒體粘度的變化，并且在優(yōu)異光穩(wěn)定性的加持下，能夠通過探針實(shí)時(shí)觀察到活細(xì)胞中線粒體的動(dòng)態(tài)變化。

8、本發(fā)明的第二方面，提供了上述高信噪比的線粒體粘度響應(yīng)熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

9、(1)將5,6-二氯-2-甲基苯并咪唑和碘乙烷混合后溶于乙腈中，反應(yīng)，洗滌反應(yīng)產(chǎn)物，得化合物c1；

10、(2)將化合物c1和8-羥基久洛尼啶-9-甲醛混勻后，溶解于乙醇中，得混合物，再加入哌啶，反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后，除去乙醇并純化，即得熒光探針。

11、優(yōu)選的，步驟(1)中，所述5,6-二氯-2-甲基苯并咪唑、碘乙烷和乙腈的加入量比為(1.8-2.2)mmol：(2.0-2.4)mmol：(8-12)ml。

12、優(yōu)選的，步驟(1)中，反應(yīng)溫度為80-90℃，反應(yīng)時(shí)間為10-14h。

13、優(yōu)選的，步驟(2)中，所述化合物c1、8-羥基久洛尼啶-9-甲醛和哌啶的加入量比為(0.8-1.2)mmol：(1.0-2.0)mmol：(90-110)μl。

14、優(yōu)選的，步驟(2)中，反應(yīng)溫度為80-90℃，反應(yīng)時(shí)間為10-14h。

15、上述制備方法涉及的化學(xué)反應(yīng)式如下所示：

16、

17、本發(fā)明的第三方面，提供了上述高信噪比的線粒體粘度響應(yīng)熒光探針在染色活細(xì)胞中線粒體上的應(yīng)用。

18、優(yōu)選的，所述活細(xì)胞為大鼠胚胎心肌細(xì)胞(h9c2)。

19、優(yōu)選的，所述熒光探針jl-jc的激發(fā)光波長是488nm，在550-650nm的波長范圍發(fā)出明亮的熒光，使線粒體顯示出綠色的熒光偽彩色。

20、優(yōu)選的，所述熒光探針jl-jc在染色活細(xì)胞中線粒體過程中，具有較低的細(xì)胞染色濃度和極快的染色時(shí)間。

21、進(jìn)一步優(yōu)選的，細(xì)胞染色濃度為1μm、染色時(shí)間為10min。

22、當(dāng)細(xì)胞染色濃度為1μm、染色時(shí)間為10min時(shí)，就可以清晰觀察到細(xì)胞內(nèi)花絲狀的線粒體結(jié)構(gòu)。相較于商用線粒體探針mtdr和mtg，本發(fā)明的熒光探針jl-jc具有更高的成像信噪比。

23、具體的，商用線粒體探針mtdr、mtg在共聚焦成像時(shí)具有較高的背景信號(hào)，在標(biāo)記區(qū)域中熒光信號(hào)的信噪比分別為4.3倍和23.3倍，而本發(fā)明的熒光探針jl-jc背景信號(hào)的信噪比為37倍。由此可見，探針jl-jc的成像信噪比能力要明顯高于探針mtdr和mtg，探針jl-jc優(yōu)異的信噪比成像能力為其在固定視野下長程追蹤線粒體的動(dòng)態(tài)變化提供了可能。另外，探針jl-jc具有良好的生物相容性。

24、本發(fā)明的第四方面，提供了上述高信噪比的線粒體粘度響應(yīng)熒光探針在原位監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中線粒體動(dòng)態(tài)變化中的應(yīng)用。

25、優(yōu)選的，所述活細(xì)胞為大鼠胚胎心肌細(xì)胞，所述線粒體動(dòng)態(tài)變化包括線粒體的斷裂和融合。

26、具體的，采用熒光探針jl-jc對(duì)活細(xì)胞中的線粒體染色后，在顯微鏡的固定視野下觀察600s，可以清晰觀察到活細(xì)胞中的線粒體發(fā)生斷裂，與此同時(shí)，活細(xì)胞中的線粒體的融合也被清晰的觀察到。

27、本發(fā)明的第五方面，提供了上述高信噪比的線粒體粘度響應(yīng)熒光探針在粘度響應(yīng)中的應(yīng)用。

28、優(yōu)選的，所述熒光探針對(duì)活細(xì)胞病理模型和/或環(huán)境變化導(dǎo)致的粘度變化做出靈敏響應(yīng)。

29、具體的，經(jīng)體外光譜測(cè)試發(fā)現(xiàn)，在不同水-甘油比的溶劑中，本發(fā)明的熒光探針jl-jc的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨甘油占比的增加而表現(xiàn)出明顯的加強(qiáng)。由此可見，其對(duì)環(huán)境粘度有敏感響應(yīng)。當(dāng)采用不同濃度的制菌霉素(nystatin)處理細(xì)胞誘導(dǎo)線粒體粘度增加時(shí)，會(huì)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組(未采用制菌霉素)的熒光發(fā)射強(qiáng)度相比，經(jīng)制菌霉素處理過的細(xì)胞，探針的熒光亮度明顯增強(qiáng)，并且與制菌霉素的處理濃度呈正相關(guān)關(guān)系。另外，將同一批細(xì)胞進(jìn)行低溫處理，同樣觀察到由于線粒體粘度增加而引起的熒光發(fā)生強(qiáng)度增強(qiáng)。

30、本發(fā)明的第六方面，提供了上述高信噪比的線粒體粘度響應(yīng)熒光探針在制備生物體體內(nèi)線粒體染色產(chǎn)品和監(jiān)測(cè)生物體體內(nèi)線粒體粘度變化的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

31、優(yōu)選的，所述生物體為斑馬魚。

32、具體的，通過對(duì)3日齡的斑馬魚經(jīng)不同濃度的制菌霉素處理后，與對(duì)照組(未對(duì)斑馬魚進(jìn)行制菌霉素處理)相比，斑馬魚體內(nèi)的熒光發(fā)射強(qiáng)度有明顯的增強(qiáng)，并且強(qiáng)度變化與藥物濃度呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)關(guān)系，由此可見，探針jl-jc可用于制備生物體體內(nèi)線粒體染色產(chǎn)品和監(jiān)測(cè)生物體體內(nèi)線粒體粘度變化的產(chǎn)品。

33、本發(fā)明的有益效果：

34、本發(fā)明公開了一種具有高信噪比、粘度響應(yīng)型線粒體長程追蹤熒光探針jl-jc，熒光探針jl-jc利用線粒體內(nèi)膜具有-180mv電位的性質(zhì)，通過靜電作用靶向線粒體，具有比商業(yè)化探針mtdr和mtg更加優(yōu)異的信噪比。且本發(fā)明的熒光探針jl-jc的細(xì)胞染色濃度低，染色時(shí)間快，有優(yōu)異的生物相容性，在復(fù)雜的環(huán)境中只對(duì)線粒體粘度具有靈敏的響應(yīng)性。

35、本發(fā)明的熒光探針jl-jc可以染色體外活細(xì)胞中的線粒體，且在優(yōu)異光穩(wěn)定的前提下，可以原位監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中線粒體的斷裂、融合動(dòng)態(tài)變化。值得注意的是，熒光探針jl-jc能夠正確反饋出活細(xì)胞由于藥物處理或者是環(huán)境變化引起的線粒體粘度的變化；同時(shí)，還可用于制備生物體體內(nèi)線粒體染色產(chǎn)品和監(jiān)測(cè)生物體體內(nèi)線粒體粘度變化的產(chǎn)品。由此可見，本發(fā)明的熒光探針jl-jc可作為檢測(cè)生物體線粒體粘度變化的獨(dú)特潛在工具，也為后續(xù)轉(zhuǎn)子型線粒體粘度響應(yīng)探針的研究提供了新思路。