本發(fā)明屬于基因工程，具體地說，是關于一種高產番茄紅素的畢赤酵母基因工程菌。

背景技術：

1、番茄紅素作為類胡蘿卜素家族中的重要成員，是一種脂溶性多不飽和烯烴化合物，因其優(yōu)異的單線態(tài)氧猝滅能力或捕獲超氧自由基的能力而具有很強的抗氧化能力。因此，它廣泛用于化妝品、藥品、食品添加劑等領域。

2、傳統(tǒng)的番茄紅素生產方法主要通過從水果和蔬菜中自然提取，但由于提取產量低，難以滿足日益增長的市場需求?；瘜W合成也是可行的，但由于其復雜的結構，使得這一過程復雜且成本高昂，同時也帶來了環(huán)境污染和健康問題。相比之下，微生物發(fā)酵提供了一種更經(jīng)濟和可持續(xù)的替代方法，使大規(guī)模的番茄紅素合成成為可能。

3、早在20世紀90年代，番茄紅素就已在大腸桿菌和釀酒酵母中異源合成。迄今為止，最高產量在大腸桿菌中已達到448mg/g干細胞重量(dcw)。然而，大腸桿菌釋放的內毒素帶來了顯著的食品安全問題。因此，使用gras酵母作為異源合成番茄紅素的宿主可能是一個更好的選擇。周魁等通過自適應進化成功增加了釀酒酵母中的番茄紅素產量，在7l發(fā)酵罐中達到了8.15g/l。此外，馬永碩等通過重新分配碳通量和利用蛋白質工程增加了油脂耶氏酵母中的番茄紅素產量。

4、作為甲基營養(yǎng)酵母，畢赤酵母能夠在簡單培養(yǎng)基中使用甲醇作為唯一碳源和能源進行高密度發(fā)酵并合成高附加值化學品，因而引起了研究者的極大興趣。特別是甲醇，這種非食物液體c1原料可以通過co2的加氫生產，具有低成本、易獲取和易運輸?shù)膬?yōu)點，有望緩解溫室效應。此外，甲醇每個碳原子的還原程度比葡萄糖和甘油更高，因此在理論上更有利于合成還原化學品，如萜類和醇類。近年來，基于crispr的基因編輯技術的深入研究催生了畢赤酵母在從甲醇合成多種高價值化學品中的廣泛應用，包括萜類、脂肪酸、硫酸軟骨素等。然而，目前在畢赤酵母中進行番茄紅素生物合成的研究較少。

5、異戊二烯焦磷酸(fpp)是番茄紅素生物合成的內源前體。在酵母中，fpp由鯊烯合酶(erg9p)催化生成鯊烯，鯊烯隨后轉化為生長必需的麥角固醇，因此敲除鯊烯合酶以將fpp引導至番茄紅素合成是不現(xiàn)實的。因此，fpp流的分配對于平衡細胞生長和番茄紅素生物合成至關重要。合理調控erg9p的活性是一種減少fpp非生產性消耗的有效策略。最近，張心穎等通過crispri抑制下游競爭途徑提高了番茄紅素的產量，但未能動態(tài)平衡細胞生長和產品合成。因此，迫切需要一種更靈活的策略來調控erg9p的活性。

6、過量的類胡蘿卜素積累已被證明會整合到富含脂質的區(qū)域，如質膜和脂肪滴，導致細胞膜破壞和氧化應激。亞細胞隔離是細胞工廠高效合成高價值化學品的一種有效策略，它不僅可以提高合成效率，還可以減輕產品對細胞的毒性。特別是單膜的過氧化物酶體，其內部已被驗證具有疏水環(huán)境，是萜類合成和儲存的理想場所。

技術實現(xiàn)思路

1、本技術的發(fā)明人在之前的研究中，將編碼香葉基香葉基焦磷酸合酶(ggpps)、番茄紅素合成酶和番茄紅素脫氫酶的外源基因crte、crtybw61r和crti，以及編碼hmg-coa還原酶的thmg1基因定位于胞質中，獲得了一株能夠合成番茄紅素的畢赤酵母菌株tx-l3，但產量相對較低。為此，發(fā)明人在tx-l3的基礎上繼續(xù)對其代謝途徑進行了逐級改造，成功地獲得了番茄紅素產量顯著提高的系列基因工程菌。

2、因此，本發(fā)明的第一個方面，提供了一種高產番茄紅素的畢赤酵母基因工程菌zw113，所述工程菌zw113是以畢赤酵母菌株tx-l3為出發(fā)菌株，在其iii-10位點整合分別以pgap和tdas2為啟動子和終止子、且在c末端融合過氧化物酶體靶向信號肽epts1的crti基因pgap-crti-epts1-tdas2，分別以pgap和tfba1為啟動子和終止子、且在c末端融合過氧化物酶體靶向信號肽epts1的crtyb基因pgap-crtybw61r-epts1-tfba1，以及分別以pgap和tcat1tt為啟動子和終止子、且在c末端融合過氧化物酶體靶向信號肽epts1的crte基因pgap-crte-epts1-tcat1tt而得到，其中：

3、基因crti的genbank登錄號為:ay177424.1，基因crtyb的genbank登錄號為:ay177204.1，基因crte的genbank登錄號為:dq016502.1，且上述基因均按照畢赤酵母的偏好性進行了密碼子優(yōu)化。

4、本發(fā)明的第二個方面，提供了一種高產番茄紅素的畢赤酵母基因工程菌zw137，所述工程菌zw137是以上述的工程菌zw113為出發(fā)菌株，將編碼角鯊烯合酶的erg9的啟動子替換為perg8-ubi-kn113而得到，其中：

5、perg8是畢赤酵母內源編碼磷酸甲羥戊酸激酶的基因erg8的啟動子，基因erg8的ncbi登錄號為xm_002491823.1；ubi為內源泛素蛋白基因，其genbank登錄號為cah2450568.1，kn113為蛋白質n端降解信號序列。

6、本發(fā)明的第三個方面，提供了一種高產番茄紅素的畢赤酵母基因工程菌zw205，所述工程菌zw205是以上述的工程zw137為出發(fā)菌株，在其ii-6位點整合分別以pgap和taox1為啟動子和終止子的mvd1基因pgap-mvd1-taox1而得到，其中，mvd1的ncbi登錄號為：xm_002490072.1。

7、本發(fā)明的第四個方面，提供了一種高產番茄紅素的畢赤酵母基因工程菌zw243，所述工程菌zw243是以上述的工程菌zw205為出發(fā)菌株，在其ii-4位點整合分別以pgap和tpmp20為啟動子和終止子的erg10基因pgap-erg10-tpmp20而得到，其中，erg10的ncbi登錄號為：xm_002490381.1。

8、本發(fā)明的第五個方面，提供了一種高產番茄紅素的畢赤酵母基因工程菌zw267，所述工程菌zw267是以上述的工程菌zw243為出發(fā)菌株，在其iii-4位點整合分別以pgap和tpmp20為啟動子和終止子、且以ggggs連接的crte和erg20基因pgap-crte-ggggs-erg20-tpmp20而得到，其中，基因erg20的ncbi登錄號為：xm_002490391.1。

9、本發(fā)明的第六個方面，提供了一種高產番茄紅素的畢赤酵母基因工程菌zw327，所述工程菌zw327是以上述的工程菌zw267為出發(fā)菌株，在其i-2位點整合分別以pgap和tpmp20為啟動子和終止子的pas_chr2-2_0003基因pgap-pas_chr2-2_0003-tpmp20而得到，其中，基因pas_chr2-2_0003的ncbi登錄號為：xm_002492168.1。

10、本發(fā)明的第七個方面，提供了一種高產番茄紅素的畢赤酵母基因工程菌zw303，所述工程菌zw303是以上述的工程菌zw267為出發(fā)菌株，在ii-5位點整合分別以paox1和tgcw14為啟動子和終止子的das1基因paox1-das1-tgcw14、分別以paox1和ttpi1為啟動子和終止子的rki1基因paox1-rki1-ttpi1、以及分別以paox1和tgcw14為啟動子和終止子的tal2基因paox1-tal2-tgcw14而得到，其中：

11、基因das1的ncbi登錄號為：xm_002493018.1，rki1的ncbi登錄號為：xm_002493573.1，tal2的ncbi登錄號為：xm_002491803.1。

12、本發(fā)明的第八個方面，提供了一種高產番茄紅素的畢赤酵母基因工程菌zw306，所述工程菌zw306是以上述的工程菌zw303為出發(fā)菌株，在其dna?ligase?iv位點整合分別以paox1和tdas2為啟動子和終止子、且在c末端融合過氧化物酶體靶向信號肽epts1的anxfpk基因paox1-anxfpk-epts1-tdas2、以及分別以pgap和ttpi1為啟動子和終止子、且在c末端融合過氧化物酶體靶向信號肽epts1的bsupta基因pgap-bsupta-epts1-ttpi1而得到，其中：

13、基因anxfpk的genbank登錄號為:xp_001399780.1，bsupta的genbank登錄號為:wp_003243393.1。

14、本發(fā)明的第九個方面，提供了一種高產番茄紅素的畢赤酵母基因工程菌zw352，所述工程菌zw352是以上述的工程菌zw303為出發(fā)菌株，在其i-2位點整合分別以paox1和tpmp20為啟動子和終止子的pas_chr2-2_0003基因pgap-pas_chr2-2_0003-tpmp20而得到，其中，基因pas_chr2-2_0003的ncbi登錄號為：xm_002492168.1。

15、本發(fā)明具有以下有益效果：

16、1、本發(fā)明以畢赤酵母菌株tx-l3為出發(fā)菌株，嘗試了諸多代謝途徑的改造策略，從中篩選獲得了多個基因工程菌株，番茄紅素的產量得到了明顯的提高。

17、2、獲得的高產番茄紅素的工程菌中，菌株zw327和zw352的結果最為突出，其中菌株zw327經(jīng)5升生物反應器發(fā)酵的番茄紅素產量最高達到8.4g/l；菌株zw352的發(fā)酵過程中使用甘油補料結合甲醇誘導的方式，番茄紅素產量達到了10.2g/l。