本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)干細(xì)胞培養(yǎng)，具體涉及一種血管發(fā)育相關(guān)牙髓干細(xì)胞亞群的體外提取、擴(kuò)增方法。

背景技術(shù)：

1、齲齒和創(chuàng)傷性損傷通常會導(dǎo)致牙髓疾病，常規(guī)治療(如根管手術(shù))通常會導(dǎo)致牙髓活力喪失，影響牙齒發(fā)育。與傳統(tǒng)方法相比，再生醫(yī)學(xué)，包括自體干細(xì)胞歸巢和干細(xì)胞移植，在牙髓再生方面受到關(guān)注。牙髓血管豐富，必須促進(jìn)血管發(fā)育，才能成功再生和恢復(fù)生理功能。盡管這些研究取得了進(jìn)展，但由于牙髓發(fā)育過程的復(fù)雜性和技術(shù)限制，控制牙髓血管發(fā)育的錯綜復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制仍不明確。

2、探索牙髓血管發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，并利用這一知識指導(dǎo)牙髓再生，提供了一個新穎的研究方向。間充質(zhì)干細(xì)胞可能在血管化過程中起著至關(guān)重要的作用。牙髓干細(xì)胞(dpscs)作為牙髓穩(wěn)態(tài)和損傷修復(fù)的關(guān)鍵參與者，在牙髓再生治療中具有巨大的潛力。早期研究揭示了血管和神經(jīng)周圍“干細(xì)胞龕”中存在dpscs，提示它們之間存在潛在的直接或間接調(diào)控關(guān)系。具體來說，包括內(nèi)皮細(xì)胞(ecs)和dpscs在內(nèi)的各種細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊可能是誘導(dǎo)血管化的關(guān)鍵因素。

3、目前，相關(guān)研究通過對單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)的分析以及體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，確定了fn1-itga5介導(dǎo)的dpscs和ecs細(xì)胞間通訊是促進(jìn)血管發(fā)育的至關(guān)重要的因素。這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)研究dpscs促進(jìn)血管生成的調(diào)控機(jī)制及其臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

4、隨著人口老齡化壓力增大，衰老相關(guān)疾病的防治成為亟需突破的科學(xué)問題。來自牙髓不同發(fā)育階段的dpscs表現(xiàn)出適應(yīng)其生理功能的特征。在牙髓發(fā)育的早期階段，牙髓干細(xì)胞主要有助于牙齒形成。這些細(xì)胞具有較高的增殖能力和多向分化潛能，能夠分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞和其他形成牙髓組織的細(xì)胞類型。隨著牙齒成熟，牙髓干細(xì)胞發(fā)生年齡相關(guān)變化，包括數(shù)量減少和維持內(nèi)部穩(wěn)態(tài)能力增強(qiáng)。隨著年齡的增長，干細(xì)胞的再生潛能逐漸降低，可能與細(xì)胞老化、微環(huán)境的變化和細(xì)胞外基質(zhì)的改變有關(guān)。同樣，現(xiàn)有的研究表明，與來自年輕乳牙的dpscs相比，來自成熟恒牙的dpscs在促進(jìn)血管生成方面表現(xiàn)出較低的有效性。在干細(xì)胞的臨床應(yīng)用中，如何獲取自體來源且具有較強(qiáng)促血管生成特性的牙髓干細(xì)胞成為了難題，目前尚沒有見到有效方法來解決這一難題。因此，找到一種有效的方法來確保來自不同年齡和條件供體的dpscs始終表現(xiàn)出促進(jìn)血管生成的能力是很重要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種血管發(fā)育相關(guān)牙髓干細(xì)胞亞群的體外提取、擴(kuò)增方法，目的確保來自不同年齡和條件供體的且具有較強(qiáng)促血管生成特性的自體來源牙髓干細(xì)胞。通過該方法對探索維持dpscs自我更新、穩(wěn)定擴(kuò)增以及促成血管性能的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步拓寬dpscs的臨床應(yīng)用前景，為推進(jìn)牙髓再生治療提供了必要的研究基礎(chǔ)。

2、本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

3、一種血管發(fā)育相關(guān)牙髓干細(xì)胞亞群的體外提取、擴(kuò)增方法，包括以下步驟：

4、s1、獲取牙髓組織；

5、s2、進(jìn)行牙髓組織消化；

6、s3、將消化后的牙髓組織通過細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，獲得第一細(xì)胞懸液，對所述第一細(xì)胞懸液進(jìn)行離心、棄上清，加入pbs重懸細(xì)胞，得到第二細(xì)胞懸液；

7、s4、進(jìn)行細(xì)胞染色

8、在不同試管中加入等量的所述第二細(xì)胞懸液，分別設(shè)置為空白對照組、同型對照組和pdgfrβ染色組；

9、在每個試管中加入1％bsa溶液以阻斷非特異性結(jié)合，進(jìn)行第一次避光孵育；

10、向所述pdgfrβ染色組中加入稀釋后的pdgfrβ抗體，向同型對照組中加入稀釋后的同型對照抗體，進(jìn)行次二次避光孵育；

11、s5、進(jìn)行細(xì)胞洗滌

12、在所有試管中加入pbs洗滌細(xì)胞，進(jìn)行離心、棄上清，使用pbs洗滌，重復(fù)至少兩次；

13、最后一次洗滌后，將細(xì)胞重懸于pbs中，得到第三細(xì)胞懸液；

14、s6、流式細(xì)胞術(shù)分選

15、使用流式細(xì)胞儀對所述第三細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞分析和分選，收集分選pdgfrβ+dpscs；

16、s7、將收集分選后的所述pdgfrβ+dpscs，接種于dmem培養(yǎng)基中并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)所述pdgfrβ+dpscs的擴(kuò)增。

17、進(jìn)一步地，步驟s1中，所述獲取牙髓組織，具體為：

18、從牙齒替換拔除的健康乳牙或由于正畸拔除的恒前磨牙及第三磨牙中獲取牙髓組織，將獲取的牙髓組織置于含有dmem和100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)皿中。

19、進(jìn)一步地，步驟s2中，所述進(jìn)行牙髓組織消化，具體為：

20、將所述牙髓組織切成小塊，放入含有2mg/ml膠原酶和0.25％胰蛋白酶的消化液中，于37℃水浴中消化1小時(shí)。

21、進(jìn)一步地，步驟s3中，所述細(xì)胞濾網(wǎng)為70μm細(xì)胞濾網(wǎng)；

22、對所述第一細(xì)胞懸液進(jìn)行離心具體為：使用離心機(jī)以1000rpm對所述第一細(xì)胞懸液離心5分鐘。

23、進(jìn)一步地，步驟s4中，所述進(jìn)行第一次避光孵育具體為：在4℃避光孵育10分鐘；

24、所述pdgfrβ抗體的稀釋倍數(shù)為100倍，稀釋方法為：將2μlpdgfrβ抗體加入198μlpbs中；

25、所述同型對照抗體的稀釋倍數(shù)為100倍；

26、所述進(jìn)行第二次避光孵育具體為：在4℃避光孵育15分鐘。

27、進(jìn)一步地，步驟s6中，所述流式細(xì)胞儀的參數(shù)設(shè)置為：激光波長488nm，檢測通道fitc，電壓設(shè)置為500v。

28、進(jìn)一步地，步驟s7中，所述dmem培養(yǎng)基中含有10％fbs和1％青霉素-鏈霉素；

29、所述培養(yǎng)箱為37℃、5％co2培養(yǎng)箱。

30、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

31、本發(fā)明提供了一種血管發(fā)育相關(guān)牙髓干細(xì)胞亞群的體外提取、擴(kuò)增方法，通過該方法提純培養(yǎng)的pdgfrβ+dpscs具有較強(qiáng)的增殖、遷移以及促血管生成性能，本發(fā)明可以一定程度上實(shí)現(xiàn)在臨床環(huán)境下穩(wěn)定獲取來自不同年齡和條件供體的且具有較強(qiáng)促血管生成特性的自體來源牙髓干細(xì)胞。與現(xiàn)有方案相比，本方案在穩(wěn)定獲取來自不同年齡和條件供體的且具有較強(qiáng)促血管生成特性的自體來源牙髓干細(xì)胞的優(yōu)越性如下：

32、①提高dpscs的穩(wěn)定性和一致性：通過單細(xì)胞測序和流式細(xì)胞術(shù)精確識別和分選出pdgfrβ+dpscs亞群，能夠顯著提高dpscs在不同供體之間的一致性，減少因供體年齡和條件差異引起的變異性?；蚓庉嫼涂寡趸瘎┨幚淼确椒赡茈y以應(yīng)對不同供體之間的變異性，而本方案通過特定細(xì)胞亞群的篩選和富集從源頭上解決了這一問題；

33、②干細(xì)胞促血管生成能力穩(wěn)定：pdgfrβ+dpscs亞群在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的促血管生成能力，這種能力在牙髓再生中具有重要意義，有助于提升再生療效。環(huán)境因素調(diào)控和藥物干預(yù)等方法雖然可以在一定程度上提高細(xì)胞功能，但其效果可能不如直接使用高促血管生成能力的細(xì)胞亞群顯著和穩(wěn)定；

34、③克服干細(xì)胞老化問題：通過pdgfr/pi3k/akt信號通路的調(diào)控，能夠有效延緩pdgfrβ+dpscs的老化，保持其高增殖和遷移能力，從而確保其在牙髓再生中的長期效果?；蚓庉嫼涂寡趸瘎┨幚淼确椒赡艽嬖陂L期安全性問題，而本方案通過自然選擇具有高功能的細(xì)胞亞群，可以更安全地延緩干細(xì)胞老化。