本發(fā)明涉及生物材料，具體涉及utr調(diào)控元件、應(yīng)用及提高細(xì)菌中基因表達(dá)的方法。

背景技術(shù)：

1、基因工程在細(xì)菌中表達(dá)外源蛋白的能力，已經(jīng)徹底革新了獲取這些蛋白質(zhì)的途徑，使得它們在科研、工業(yè)以及治療等多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。然而，為了滿足不斷增長的需求，我們需要采用成本低效益高的大規(guī)模生產(chǎn)方法，同時(shí)確保這些蛋白質(zhì)的純度和安全性。

2、ompamrna作為大腸桿菌中最穩(wěn)定的mrna之一。研究發(fā)現(xiàn)，這種天然存在的mrna的5’utr通過形成二級結(jié)構(gòu)(即發(fā)夾結(jié)構(gòu))來增強(qiáng)mrna的穩(wěn)定性，并調(diào)控基因表達(dá)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列特征，包括莖的長度、莖中g(shù)c的含量、環(huán)的大小、莖環(huán)中的核糖核酸酶裂解位點(diǎn)，以及發(fā)夾與5’末端的距離等，都直接影響mrna的穩(wěn)定性。盡管如此，目前很少關(guān)于發(fā)夾與核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)之間單鏈區(qū)的相關(guān)研究。此外，對3'utr的研究中，大多集中在天然3'utr對基因表達(dá)的調(diào)控作用上，缺乏對3'utr結(jié)構(gòu)和序列的設(shè)計(jì)，從而難以實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供utr調(diào)控元件、應(yīng)用及提高細(xì)菌中基因表達(dá)的方法，以解決現(xiàn)有mrna的穩(wěn)定性低及其體內(nèi)翻譯效率不高的問題。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、utr調(diào)控元件，所述utr調(diào)控元件的核苷酸序列如seq?id?no:1、seq?id?no:2、seqid?no:3、seq?id?no:4、seq?id?no:5、seq?id?no:6、seq?id?no:7、seq?id?no:8、seq?idno:9、seq?id?no:10、seq?id?no:11、seq?id?no:12、seq?id?no:13、seq?id?no:14和seq?idno:15中所示的至少一種。

4、優(yōu)選的，設(shè)計(jì)5'utr中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)與核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)之間的單鏈長度，得到的所述utr調(diào)控元件的核苷酸序列如dr1-0(seq?id?no.1)、dr1-10(seq?id?no.2)、dr1-20(seq?id?no.3)、dr1-25(seq?id?no.4)、dr1-30(seq?id?no.5)和dr1-40(seq?id?no.6)所示。

5、其中，seq?id?no.1單鏈核酸(48nt)：

6、ggtgtctgtgccggtagaggcacagacaccaaagaggagaaatactag；

7、seq?id?no.2單鏈核酸(58nt)：

8、ggtgtctgtgccggtagaggcacagacaccaaaacaaaacaaagaggagaaatactag；

9、seq?id?no.3單鏈核酸(68nt)：

10、ggtgtctgtgccggtagaggcacagacaccaaaacaaaacaaaacaaaacaaagaggagaaatactag；

11、seq?id?no.4單鏈核酸(73nt)：

12、ggtgtctgtgccggtagaggcacagacaccaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaagaggagaaatactag；

13、seq?id?no.5單鏈核酸(78nt)：

14、ggtgtctgtgccggtagaggcacagacaccaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaagaggagaaatactag；

15、seq?id?no.6單鏈核酸(88nt)：

16、ggtgtctgtgccggtagaggcacagacaccaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaagaggagaaatactag。

17、優(yōu)選的，設(shè)計(jì)5'utr中的二級結(jié)構(gòu)，得到的所述utr調(diào)控元件的核苷酸序列如g-18(seq?id?no.7)和g-25(seq?id?no.8)所示。

18、其中，seq?id?no.7單鏈核酸(51nt)：

19、gggtgggtgggtgggaaaaccaaaatactagagaaagaggagaaatactag；

20、seq?id?no.8單鏈核酸(58nt)：

21、gggtgggtgggtgggaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaagaggagaaatacta?g。

22、優(yōu)選的，設(shè)計(jì)5'utr中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)與核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)之間的單鏈的gc含量，得到的所述utr調(diào)控元件的核苷酸序列如p0(seq?id?no.9)、dr1-25/p20(seq?id?no.4)、p32(seq?id?no.10)、p44(seq?id?no.11)和p60(seq?id?no.12)所示。

23、其中，seq?id?no.9單鏈核酸(73nt)：

24、ggtgtctgtgccggtagaggcacagacaccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagaggagaaatactag；

25、seq?id?no.4dr1-25/p20單鏈核酸(73nt)：

26、ggtgtctgtgccggtagaggcacagacaccaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaagaggagaaatactag；

27、seq?id?no.10單鏈核酸(73nt)：

28、ggtgtctgtgccggtagaggcacagacaccagaaacaaaacccacaaacaaaacaaaagaggagaaatactag；

29、seq?id?no.11單鏈核酸(73nt)：

30、ggtgtctgtgccggtagaggcacagacaccgcccaaagaaaacacaaaacccaagaaagaggagaaatactag；

31、seq?id?no.12單鏈核酸(73nt)：

32、ggtgtctgtgccggtagaggcacagacaccttcacacccgttaccccaccccgataaagaggagaaatactag。

33、優(yōu)選的，設(shè)計(jì)3'utr中插入可二聚的rna適配體corn結(jié)構(gòu)，得到的所述utr調(diào)控元件的核苷酸序列如1×corn(seq?id?no.13)、5×corn(seq?id?no.14)和7×corn(seq?idno.15)所示。

34、其中，seq?id?no.13單鏈核酸(45nt)：

35、tactagaggctgcgaggaaggaggtctgaggaggtcactgcagct

36、seq?id?no.14單鏈核酸(193nt)：

37、tactagaggctgcgaggaaggaggtctgaggaggtcactgcagctgcagcgaggaaggaggtctgaggaggtcactgctgctggcacgaggaaggaggtctgaggaggtcactgtgcctggtacgaggaaggaggtctgaggaggtcactgtacctgtcgcgaggaaggaggtctgaggaggtcactgcgact；

38、seq?id?no.15單鏈核酸(267nt)：

39、tactagaggctgcgaggaaggaggtctgaggaggtcactgcagctgcagcgaggaaggaggtctgaggaggtcactgctgctggcacgaggaaggaggtctgaggaggtcactgtgcctggtacgaggaaggaggtctgaggaggtcactgtacctgtcgcgaggaaggaggtctgaggaggtcactgcgactggcgcgaggaaggaggtctgaggaggtcactgcgcctggcgcgaggaaggaggtctgaggaggtcactgcgcct。

40、本發(fā)明還提供一種如本發(fā)明所述的utr調(diào)控元件在提高細(xì)菌中藥物表達(dá)效率中的應(yīng)用。

41、本發(fā)明的utr調(diào)控元件能有效提高mrna穩(wěn)定性及蛋白翻譯效率的調(diào)控機(jī)制，并適用于不同基因回路的基因表達(dá)調(diào)控，為合成生物學(xué)的研究提供了構(gòu)建基因回路的基礎(chǔ)。

42、本發(fā)明還提供一種提高細(xì)菌中基因表達(dá)的方法，包括以下步驟：

43、(1)以pbr322或pet28a(+)作為載體，在pbr322或pet28a(+)的多克隆位點(diǎn)插入目的基因；

44、(2)重組質(zhì)粒構(gòu)建：在目的基因的上游插入設(shè)計(jì)的5'utr及啟動(dòng)子，在目的基因的下游插入設(shè)計(jì)的3'utr和終止子，實(shí)現(xiàn)重組質(zhì)粒的構(gòu)建；

45、所述目的基因選自gfp、熒光素酶或者pfldh基因；

46、(3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌bl21等宿主，隨后進(jìn)行液體和固體培養(yǎng)，最終實(shí)現(xiàn)目的基因表達(dá)的提高。

47、其中，pbr322和pet28a(+)都是分子生物學(xué)中常用的質(zhì)粒載體。

48、pbr322是一種廣宿主范圍的質(zhì)粒，最初在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)。它是一種閉環(huán)雙鏈dna分子，常用于基因克隆和表達(dá)。pbr322具有自我復(fù)制、自我傳遞的特性，并且可以攜帶抗生素抗性基因，這使得它在轉(zhuǎn)化過程中易于篩選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞。

49、pet28a(+)是一種基于pet系統(tǒng)的表達(dá)載體，專門用于在大腸桿菌中高效表達(dá)重組蛋白。它含有大腸桿菌的t7噬菌體啟動(dòng)子，可以驅(qū)動(dòng)插入的外源基因進(jìn)行高水平的蛋白表達(dá)。pet28a(+)載體同樣具有抗生素抗性標(biāo)記，便于轉(zhuǎn)化后的篩選。與pbr322相比，pet28a(+)更專注于蛋白表達(dá)應(yīng)用。

50、目的基因的序列來自ncbi。以utr的命名作為重組質(zhì)粒的名稱。

51、優(yōu)選的，所述5'utr中的rbs序列選自igem數(shù)據(jù)庫中的bba_b0034，rbs序列為bba_b0034(seq?id?no.16)，啟動(dòng)子為bba_j23116(seq?id?no.17)，終止子為bba_b0015(seq?idno.18)。

52、其中，seq?id?no.16單鏈核酸(12nt)：

53、aaagaggagaaa；

54、seq?id?no.17單鏈核酸(35nt)：

55、ttgacagctagctcagtcctagggactatgctagc；

56、seq?id?no.18單鏈核酸(129nt)：

57、ccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgtt?gtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcg?tttata。

58、優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒構(gòu)建的宿主選自e.coli?dh10b(大腸桿菌dh10b)。

59、優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒構(gòu)建中，熱激溫度為42℃，時(shí)間為55s。

60、優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒構(gòu)建中，液體培養(yǎng)基選自500μl不含抗性的lb液體培養(yǎng)基。

61、優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒構(gòu)建中，固體培養(yǎng)基為含氨芐青霉素抗性的lb固體培養(yǎng)基。

62、優(yōu)選的，所述液體培養(yǎng)基中，搖菌過程在溫度為37℃的條件下進(jìn)行，轉(zhuǎn)速為220rpm，時(shí)間為30min。

63、優(yōu)選的，所述固體培養(yǎng)基在使用之前，還包括：正置培養(yǎng)基30min，倒置培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)。

64、本發(fā)明的有益效果：

65、1)本發(fā)明的一系列可調(diào)控基因表達(dá)的utr調(diào)控元件，能有效增強(qiáng)mrna穩(wěn)定性和提高蛋白翻譯效率，并適用于不同基因回路的基因表達(dá)調(diào)控，為合成生物學(xué)的研究提供了構(gòu)建基因回路的基礎(chǔ)。

66、2)本發(fā)明的5'utr調(diào)控元件可調(diào)控mrna穩(wěn)定性，有助于探索后期該調(diào)控元件對非編碼rna的穩(wěn)定性的影響，并將其應(yīng)用于調(diào)高小引導(dǎo)rna(sgrna)的水平，增加crispr干擾強(qiáng)度。為研究該utr調(diào)控元件在無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的基因表達(dá)調(diào)控作用，并將其應(yīng)用于調(diào)控toehold開關(guān)的穩(wěn)定性，以提高它們在診斷分析中的性能，提高病毒診斷試紙的檢測速度和穩(wěn)定性提供理論基礎(chǔ)。有助于探索該utr調(diào)控元件是否可增強(qiáng)真核生物mrna的穩(wěn)定性及翻譯效率，以期其能夠應(yīng)用于mrna療法中，促進(jìn)mrna療法的發(fā)展。

67、3)本發(fā)明中經(jīng)改造后的pet28a(+)表達(dá)質(zhì)粒可用于快速表達(dá)和純化大量用于學(xué)術(shù)和商業(yè)目的的蛋白質(zhì)。此外，該utr調(diào)控元件還可以應(yīng)用于luxr/luxi群體感應(yīng)的正反饋基因回路，以調(diào)節(jié)基因回路的雙穩(wěn)態(tài)，在生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具有推廣應(yīng)用價(jià)值。