本發(fā)明屬于生物材料，具體涉及一種五價(jià)磷酸膽堿配體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，c反應(yīng)蛋白(crp)作為一種關(guān)鍵的急性期反應(yīng)蛋白，其水平變化被廣泛用作評估體內(nèi)炎癥、感染及心血管疾病的重要指標(biāo)。近年來，隨著對c反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的深入研究，發(fā)現(xiàn)c反應(yīng)蛋白上的5個(gè)磷酸膽堿配體(pc)結(jié)合位點(diǎn)對于其生物活性及與配體的相互作用至關(guān)重要。然而，傳統(tǒng)的磷酸膽堿配體與c反應(yīng)蛋白的結(jié)合能力較弱，限制了其在診斷和治療應(yīng)用中的潛力。

2、為了解決這一難題，研究者們采用了低價(jià)配體或柔性骨架的設(shè)計(jì)思路，但這些設(shè)計(jì)無法滿足結(jié)合過程中對空間取向和距離的精確要求，導(dǎo)致在形成crp-配體復(fù)合物時(shí)產(chǎn)生不必要的熵?fù)p失或焓變不利，從而降低了整體的結(jié)合能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種五價(jià)磷酸膽堿配體及其制備方法和應(yīng)用，以解決單價(jià)磷酸膽堿與c反應(yīng)蛋白的結(jié)合能力較弱的問題，通過基于c反應(yīng)蛋白-磷酸膽堿復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)五價(jià)磷酸膽堿配體，以優(yōu)化結(jié)合過程中的熵變和焓變，從而提高二者的結(jié)合能力。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、一種五價(jià)磷酸膽堿配體，包括：

4、中心鏈，所述中心鏈為環(huán)狀；

5、互補(bǔ)鏈，所述互補(bǔ)鏈與所述中心鏈組裝形成呈單鏈和雙鏈交替排列的dna骨架，所述dna骨架的二級結(jié)構(gòu)為正五邊形；

6、所述雙鏈為剛性雙鏈，剛性雙鏈尾部為1～3個(gè)堿基尾部；

7、所述互補(bǔ)鏈末端包括磷酸膽堿配體和小分子連接部分，所述磷酸膽堿配體通過所述小分子連接部分與所述dna骨架連接。

8、根據(jù)上述技術(shù)手段，利用dna納米技術(shù)設(shè)計(jì)剛性dna骨架，通過剛性dna骨架連接剛性五價(jià)磷酸膽堿配體同時(shí)靶向5個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，提高了親和力，從而顯著提升了磷酸膽堿與c反應(yīng)蛋白的結(jié)合能力。有效解決了單價(jià)磷酸膽堿與c反應(yīng)蛋白的結(jié)合能力較弱的問題。

9、其中，所述中心鏈為環(huán)狀單鏈核酸，所述互補(bǔ)鏈的5’端或3’端修飾磷酸膽堿配體(pc)。

10、在正五邊形的五價(jià)磷酸膽堿配體中，剛性雙鏈之間的連接處，互補(bǔ)鏈未配對的兩段尾部短鏈采用相同的堿基種類，以保持一定排斥力，使其分別朝向五價(jià)磷酸膽堿配體兩面。其中，修飾磷酸膽堿配體的一面朝向受體(靶標(biāo))作為結(jié)合面；另一面背對受體(靶標(biāo))作為報(bào)告面，可修飾信號基團(tuán)，如：fam、dnazyme，可指示結(jié)合受體(靶標(biāo))的數(shù)量。

11、優(yōu)選的，所述五價(jià)磷酸膽堿配體由至少6條單鏈核酸組裝而成。

12、優(yōu)選的，所述正五邊形的邊長為4.4nm。

13、優(yōu)選的，所述中心鏈有1條。

14、優(yōu)選的，所述互補(bǔ)鏈為同一條鏈重復(fù)五次，或?yàn)?～5條不同的鏈。

15、優(yōu)選的，所述剛性雙鏈由相同的12～14對堿基組成。

16、優(yōu)選的，所述中心鏈的柔性短鏈部分由相同的序列組成，為1至2個(gè)堿基。

17、優(yōu)選的，所述尾部由1～3個(gè)堿基組成。

18、優(yōu)選的，所述尾部的游離堿基為相同的1～3個(gè)堿基。

19、其中，所述磷酸膽堿配體中，堿基a和t/u的占比為40～60％，堿基c和g的占比為40～60％。尤其應(yīng)注意堿基c和g的含量不能太高，否則可能形成g-四鏈體或i-motif。

20、優(yōu)選的，所述核酸磷酸膽堿配體中，堿基a和t/u的占比約為50％，堿基c和g的占比約為50％。

21、優(yōu)選的，所述磷酸膽堿配體(pc)為c反應(yīng)蛋白(crp)上磷酸膽堿結(jié)合位點(diǎn)的磷酸膽堿配體(pc)。

22、本發(fā)明還提供一種五價(jià)磷酸膽堿配體的制備方法，所述五價(jià)磷酸膽堿配體由核苷酸序列如seq?id?no.1～2所示單鏈核酸組裝而成。

23、seq?id?no.1單鏈核酸：(n2n113)5，長度為70nt；

24、seq?id?no.2單鏈核酸：pc-n2n1'13n2，長度為15nt；

25、n1為a、t、c、g堿基中的任意一種堿基；n2均為堿基a或均為堿基t；n1'13與n113互補(bǔ)配對。

26、優(yōu)選的，所述seq?id?no.2所示的單鏈核酸的5’端或3’端偶聯(lián)有磷酸膽堿配體。

27、其中，所用seq?id?no.1通過seq?id?no.3～4所示單鏈核酸以摩爾比為1:5～6組裝，并在t4?dna連接酶的催化作用下環(huán)化合成；所用seq?id?no.2通過seq?id?no.5與3-丁炔基(2-(三甲基銨基)乙基)磷酸酯以銅催化的疊氮-炔烴husigen環(huán)加成反應(yīng)(cuaac)合成。

28、seq?id?no.3磷酸化單鏈核酸：p-n2n113n2n113n2n113n2n113n2n113，長度為70nt；

29、seq?id?no.4單鏈核酸：n312，長度為12nt；

30、seq?id?no.5單鏈核酸：azide(n3)-n13n2n1'13n2，長度為15nt；

31、n1為a、t、c、g堿基中的任意一種堿基；n2均為堿基a或均為堿基t；n1'13與n113互補(bǔ)配對，n312與seq?id?no.3的5’端的6個(gè)堿基和3’端的6個(gè)堿基互補(bǔ)配對。

32、優(yōu)選的，五價(jià)磷酸膽堿配體的制備方法，所述五價(jià)磷酸膽堿配體采用核苷酸序列如seq?id?no.6和seq?id?no.7所示的單鏈核酸組裝而成。

33、其中，seq?id?no.6單鏈核酸：(attcgctccctacc)5；

34、seq?id?no.7單鏈核酸：phosphocholine(pc)-aggtagggagcgaaa。

35、優(yōu)選的，在所述seq?id?no.7所示的單鏈核酸的5’端或3’端偶聯(lián)有磷酸膽堿配體(pc)。

36、其中，在偶聯(lián)磷酸膽堿配體時(shí)，可根據(jù)需要調(diào)整偶聯(lián)位點(diǎn)，可以在互補(bǔ)鏈的5’端，也可以在3’端。其中，磷酸膽堿配體必須修飾在互補(bǔ)鏈的同一鏈端。

37、優(yōu)選的，所述seq?id?no.6所示的單鏈核酸通過核苷酸序列如seq?id?no.8和seqidno.9所示的單鏈核酸組裝，并在t4?dna連接酶的催化作用下環(huán)化合成，所述seq?id?no.8所示的單鏈核酸與所述seq?id?no.9所示的單鏈核酸的摩爾比為1:6。

38、優(yōu)選的，所述seq?id?no.7所示的單鏈核酸通過核苷酸序列如seq?id?no.10所示的單鏈核酸與3-丁炔基(2-(三甲基銨基)乙基)磷酸酯以銅催化的疊氮-炔烴husigen環(huán)加成反應(yīng)(cuaac)合成。

39、其中，seq?id?no.8磷酸化單鏈核酸：

40、p-attcgctccctaccattcgctccctaccattcgctccctaccattcgctccctaccattcgctccctacc；

41、seq?id?no.9單鏈核酸：gcgaatggtagg；

42、seq?id?no.10單鏈核酸：azide(n3)-aggtagggagcgaaa。

43、優(yōu)選的，所述c反應(yīng)蛋白(crp)的五價(jià)磷酸膽堿配體組裝所用緩沖液為tris-hcl+2mm?ca2+，所述緩沖液tris-hcl+2mm?ca2+的配方為：50mm三羥甲基氨基甲烷，150mm氯化鈉，1.5mm氯化鎂，2mm氯化鈣，ph為7.4。

44、優(yōu)選的，所述seq?id?no.6所示的單鏈核酸與所述seq?id?no.7所示的單鏈核酸的摩爾比為1:5。

45、優(yōu)選的，c反應(yīng)蛋白(crp)的五價(jià)磷酸膽堿配體組裝的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃反應(yīng)5min，65℃反應(yīng)30min，50℃反應(yīng)30min，37℃反應(yīng)30min，25℃反應(yīng)30min，4℃反應(yīng)2h。

46、優(yōu)選的，所述五價(jià)磷酸膽堿配體的制備方法，包括如下步驟：

47、(a)找出磷酸膽堿配體與靶蛋白作用的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，確定晶體結(jié)構(gòu)中c反應(yīng)蛋白(crp)與磷酸膽堿配體(pc)的空間位置、取向及結(jié)合位點(diǎn)之間的距離；

48、(b)設(shè)計(jì)合適的正五邊形的剛性dna骨架，使骨架的邊長等于靶蛋白上結(jié)合位點(diǎn)之間的距離；

49、(c)確定中心鏈和互補(bǔ)鏈的序列長度和堿基種類，在互補(bǔ)鏈末端連接磷酸膽堿配體(pc)，使每個(gè)配體均勻分布在dna骨架的頂點(diǎn)；

50、(d)以碳-碳單鏈連接骨架和配體來保留的柔性范圍，使得配體能夠在所述柔性范圍內(nèi)通過單鍵旋轉(zhuǎn)至合適的構(gòu)型；柔性范圍最大不超過否則剛性骨架親和力將急速降低；

51、(e)以中心鏈和互補(bǔ)鏈配對的剛性雙鏈作為骨架組成部分，以中心鏈未配對的柔性短鏈作為骨架轉(zhuǎn)角；互補(bǔ)鏈未配對的兩段末端尾部互相排斥，指向dna骨架兩面，得到多價(jià)磷酸膽堿配體的設(shè)計(jì)單元，即五價(jià)磷酸膽堿配體。dna與配體之間保留部分碳鏈。

52、其中，以中心鏈和互補(bǔ)鏈配對的剛性雙鏈作為骨架主要組成部分，發(fā)揮支撐作用；以中心鏈未配對的柔性短鏈作為骨架轉(zhuǎn)角，使剛性雙鏈之間維持一定角度；為互補(bǔ)鏈未配對的兩段尾部鏈互相排斥。

53、本發(fā)明還提供一種所述五價(jià)磷酸膽堿配體作為靶標(biāo)分子的應(yīng)用。

54、本發(fā)明的有益效果：

55、本發(fā)明提供了一種五價(jià)磷酸膽堿配體的構(gòu)建方式：(1)以中心鏈和互補(bǔ)鏈配對的剛性雙鏈作為骨架主要組成部分，發(fā)揮支撐作用，維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；柔性短鏈能帶給dna骨架一定的自由度，使剛性雙鏈之間保持一定角度，較短的柔性短鏈連接不會破壞dna骨架整體的剛性。(2)dna骨架的尺寸及配體分布：剛性的dna骨架控制配體的分布，能預(yù)組織與目標(biāo)蛋白質(zhì)相互作用的磷酸膽堿配體，在熱力學(xué)有利；骨架尺寸與蛋白(靶標(biāo))上結(jié)合位點(diǎn)之間的距離匹配，有效保證了配體結(jié)合蛋白質(zhì)，促進(jìn)了結(jié)合時(shí)的熵變和焓變有利，大幅度提高了親和力。(3)碳-碳單鏈的長度：以碳-碳單鏈連接骨架和配體來保留左右的柔性范圍，允許配體能夠在較小的范圍內(nèi)通過單鍵旋轉(zhuǎn)至合適的構(gòu)象，使配體結(jié)合時(shí)的空間取向與晶體結(jié)構(gòu)一致，使焓變有利，提高了結(jié)合親和力。

56、本發(fā)明制備的五價(jià)磷酸膽堿配體與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)具有明確方向和距離，與c反應(yīng)蛋白具有高親和力和高特異性結(jié)合，因此可在配體與相應(yīng)蛋白質(zhì)、病原微生物、小分子等靶標(biāo)相互作用的藥物設(shè)計(jì)、制劑研發(fā)、分析檢測以及藥物輸送等領(lǐng)域發(fā)揮應(yīng)用價(jià)值。且本發(fā)明的五價(jià)磷酸膽堿配體的制備方法具有操作簡單、普適性強(qiáng)、合成方法反應(yīng)條件溫和、不需高溫高壓、原料廉價(jià)易得和產(chǎn)物收率高的優(yōu)點(diǎn)。

57、本發(fā)明設(shè)計(jì)的五價(jià)磷酸膽堿配體為dna骨架的多價(jià)配體提供一種新思路?；诒景l(fā)明的設(shè)計(jì)思路，可根據(jù)靶標(biāo)分子的晶體結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步設(shè)計(jì)出親和力高、特異性高、結(jié)合度高、穩(wěn)定性好的多價(jià)配體，在生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具有推廣應(yīng)用價(jià)值。