本發(fā)明涉及基因工程、酶工程領(lǐng)域；具體涉及一種突變重組逆轉(zhuǎn)錄酶、其制備方法及應用。

背景技術(shù)：

1、逆轉(zhuǎn)錄酶(rt)是分子生物學研究和應用中廣泛使用的一種工具酶。它以rna為模板合成dna，是進行rna分析和檢測的重要手段，在基因表達分析、基因功能研究、病原體檢測、遺傳病篩查等諸多領(lǐng)域均有廣泛的使用。

2、莫羅尼鼠白血病病毒(moloney?murine?leukemia?virus,m-mlv)逆轉(zhuǎn)錄酶是一條多肽鏈，包含n端聚合結(jié)構(gòu)域與c端rnase?h結(jié)構(gòu)域。雖然該逆轉(zhuǎn)錄酶是目前常用的逆轉(zhuǎn)錄酶之一，但是該酶在應用中仍存在諸多的限制。

3、首先，m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶適宜反應溫度范圍較窄，通常為37～42℃，過低或過高的反應溫度均會使其反應效率顯著下降或失去活性。rna逆轉(zhuǎn)錄合成cdna程序中最大的挑戰(zhàn)在于rna雙股互補結(jié)構(gòu)復雜，在相對低溫時rna會形成二級結(jié)構(gòu)，這種二級結(jié)構(gòu)會影響轉(zhuǎn)錄合成cdna的效率。一般來說，可以通過提高rna逆轉(zhuǎn)錄反應溫度來降低rna二級結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。然而，普通m-mlv難以在高于55℃的溫度下良好地工作。此外，較低的溫度耐受也限制了它與交叉引物恒溫擴增等核酸擴增技術(shù)的整合。

4、其次，普通m-mlv的逆轉(zhuǎn)錄效率仍不理想，難以滿足如快速核酸檢測等應用的需求。如新型冠狀病毒的核酸檢測對檢測時間要求極其嚴格，普通m-mlv的轉(zhuǎn)錄效率較低，從而影響檢測效果。

5、最后，逆轉(zhuǎn)錄酶的實際應用中，往往會受到樣本中含有的干擾物質(zhì)的影響，導致cdna合成效率被降低。普通m-mlv對諸如乙醇、肝素、胍鹽等常見干擾物的耐受濃度較低，從而限制了其應用。

6、因此，存在著對m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶進行優(yōu)化和改良的強烈需求。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、在整個說明書中，除非另有特別說明，本文使用的術(shù)語應理解為如本領(lǐng)域中通常所使用的含義。因此，除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的一般理解相同的含義。若存在矛盾，本說明書優(yōu)先。

2、為了改良m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶，本發(fā)明人對野生型m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶進行了研究，考察了多種定點突變的突變體的效果，從而完成了本發(fā)明。

3、據(jù)此，本發(fā)明提供了一種逆轉(zhuǎn)錄酶，包括如seq?id?no:1所示的氨基酸序列。

4、本發(fā)明提供了一種逆轉(zhuǎn)錄酶，其通過在如seq?id?no:3所示的野生型m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶(源自genbank:aac82568.2)的氨基酸序列第115位、第286位、第313位、第388位、第449位和第455位進行定點突變獲得。

5、具體地，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶通過在seq?id?no:3所示的野生型m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶的基礎(chǔ)上進行l(wèi)115r、e286k、w313r、w388h、d449a和a455v定點突變而獲得。

6、在一個方面，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶具有高熱穩(wěn)定性，活性溫度為37-70℃，能夠在最高70℃下進行cdna鏈的合成。

7、另一方面，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶的擴增效率是野生型逆轉(zhuǎn)錄酶的52.4倍，且具有明顯優(yōu)于市售的耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶。

8、再一方面，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶對于多種干擾物的耐受相較于野生型m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶有明顯提高，并優(yōu)于市售的主流耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶。

9、又一方面，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶適用于恒溫擴增，并且擴增效率優(yōu)于市售的耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶。

10、在本文中，在提及氨基酸序列的突變的情況下，seq?id?no:3所示的氨基酸序列的首位t為第1位，突變例如以“突變前氨基酸殘基”+“突變位置”+“突變后氨基酸殘基”的形式描述。示例性地，l115r表示seq?id?no:3所示的氨基酸序列的第115位殘基由l突變?yōu)閞。

11、如本文所使用的，“野生型”、“野生型逆轉(zhuǎn)錄酶”或“野生型m-mlv”可互換使用，是指氨基酸序列如seq?id?no:3所示的m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶。

12、本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶的反應溫度可以在50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上或70℃以上。本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶的反應溫度可以在55℃以下、60℃以下、65℃以下、70℃以下或75℃以下。

13、本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶的反應效率是野生型逆轉(zhuǎn)錄酶的至少30倍、至少40倍或至少50倍。

14、在具體的實施方式中，逆轉(zhuǎn)錄酶的反應效率通過以下公式計算得到：

15、逆轉(zhuǎn)錄酶反應效率＝100％×2(a-b)

16、其中，a為野生型逆轉(zhuǎn)錄酶ct值，b為對照組逆轉(zhuǎn)錄酶ct值。

17、本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶對選自由以下項組成的組的一種或更多種干擾物耐受：乙醇、苯酚、甲酰胺、氯化鈉、異硫氰酸胍、鹽酸胍和肝素。例如，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶對乙醇的耐受能力(ic50)為至少10v/v％、至少12.5v/v％、至少15v/v％、至少17.5v/v％、至少20v/v％或至少22v/v％。本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶對苯酚的耐受能力(ic50)為至少1.0v/v％、至少1.25v/v％、至少1.5v/v％、至少1.75v/v％、至少2v/v％、至少3v/v％或至少4v/v％。本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶對甲酰胺的耐受能力(ic50)為至少4.5v/v％、至少5.5v/v％、至少6.5v/v％、至少7.5v/v％、至少10v/v％、至少15v/v％、至少20v/v％或至少25v/v％。本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶對氯化鈉的耐受能力(ic50)為至少110mm、至少150mm、至少200mm、至少300mm、至少400mm、至少500mm或至少600mm。本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶對異硫氰酸胍的耐受能力(ic50)為至少95mm、至少100mm、至少120mm、至少140mm、至少160mm、至少180mm或至少200mm。本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶對鹽酸胍的耐受能力(ic50)為至少90mm、至少100mm、至少120mm、至少140mm、至少160mm、至少180mm或至少200mm。本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶對肝素的耐受能力(ic50)為至少1.5u、至少1.5u、至少2u、至少2.5u、至少3u、至少4u、至少5u或至少6u。

18、本發(fā)明提供了一種核酸分子，包含編碼本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶的核苷酸序列。

19、在一些實施方式中，本發(fā)明的核酸分子的序列如seq?id?no:2所示。

20、在一些實施方式中，本發(fā)明的核酸分子經(jīng)過密碼子優(yōu)化。示例性地，依據(jù)產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶的宿主細胞的種類進行密碼子優(yōu)化。

21、本發(fā)明提供了重組載體，其包含本發(fā)明的核酸分子。通過將本發(fā)明的核酸分子連接至任何適用于插入外源序列以復制和表達的載體。示例性的載體包括但不限于pet系列、duet系列、pgex系列、phy300、phy300plk、ppiczαa、ppic3k、ppic9k、pht43、pfastbac1或ppsumo。

22、在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的重組載體選自為pet-30a(+)或pet-28a。

23、在用于本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶的情況下，pet-30a(+)或pet-28a載體具有nde?i和hindiii雙酶切位點和良好的宿主細胞兼容性。是一種高效轉(zhuǎn)錄啟動體系。

24、進一步的，本發(fā)明提供了一種宿主細胞，包含本發(fā)明的核酸分子或重組載體。

25、本發(fā)明的宿主細胞通過轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞而獲得。宿主細胞包括但不限于大腸桿菌、畢赤酵母、枯草芽孢桿菌或昆蟲細胞。

26、在優(yōu)選的實施方式中，宿主細胞是大腸桿菌bl21并且包含seq?id?no:2所示的核酸分子或含該核酸分子的重組載體。

27、通過選擇大腸桿菌bl21及密碼子優(yōu)化設(shè)計后的核酸分子，本發(fā)明的宿主細胞具有更高的表達量。

28、本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包括本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶。

29、在一些實施方式中，本發(fā)明的試劑盒進一步包括用于逆轉(zhuǎn)錄或核酸擴增其他試劑，包括但不限于rna酶抑制劑、反應緩沖液、dntp和引物中的一種或更多種。

30、在一些實施方式中，本發(fā)明的試劑盒用于交叉引物擴增(cpa)。例如，本發(fā)明的試劑盒可包括：正向外圍引物、反向外圍引物、正向交叉擴增引物、反向交叉擴增引物、增強引物和檢測探針。

31、本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合cpa，能夠?qū)崿F(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄反應與擴增反應在同一體系中進行，從而節(jié)約了檢測成本，并提高了檢測效率。

32、在一些實施方式中，本發(fā)明的試劑盒用于合成cdna。

33、在一些實施方式中，本發(fā)明的試劑盒用于核酸擴增，尤其基于逆轉(zhuǎn)錄的核酸擴增。

34、本發(fā)明提供了一種逆轉(zhuǎn)錄酶的制備方法，包括：

35、將本發(fā)明的核酸分子連接至表達載體中獲得重組載體；

36、將重組載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)宿主細胞獲得克隆菌株；以及

37、對克隆菌株進行誘導培養(yǎng)、破碎、純化后獲得逆轉(zhuǎn)錄酶。

38、在具體的實施方式中，本發(fā)明的制備方法包括：將本發(fā)明的核酸分子連接至具有nde?i和hind?iii雙酶切位點的表達載體中獲得重組載體；將重組載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)宿主細胞獲得克隆菌株，經(jīng)誘導培養(yǎng)、破碎、純化后獲得。

39、在具體的實施方式中，核酸序列是依據(jù)野生型逆轉(zhuǎn)錄酶m-mlv的氨基酸序列進行定點突變后經(jīng)密碼子優(yōu)化獲得；定點突變是將野生型m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶的第115位氨基酸從l突變?yōu)閞，第286位氨基酸從e突變?yōu)閗，第313位氨基酸從w突變?yōu)閞，第388位氨基酸從w突變?yōu)閔，第449位氨基酸從d突變?yōu)閍，第455位氨基酸從a突變?yōu)関。

40、在具體的實施方式中，本發(fā)明制備方法中的誘導培養(yǎng)的條件為16-40℃，iptg濃度0.2-5mm。

41、在具體的實施方式中，本發(fā)明制備方法中的破碎工藝包括但不限于超聲波破碎。

42、在具體的實施方式中，可對破碎離心過濾后的粗酶液進行純化，純化工藝包括但不限于鎳離子親和層析柱洗脫，收集純化后的酶液并保存。例如，洗脫可以通過采用不同咪唑濃度的tris-hcl緩沖液來進行，并選擇純度較高的洗脫液收集酶液。

43、進一步地，提供了本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶在合成cdna中的應用。

44、在具體的實施方式中，應用包括提供本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶；以及使該逆轉(zhuǎn)錄酶與核酸模板接觸以允許合成cdna。

45、進一步地，提供了本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶在核酸擴增中的應用。

46、在本發(fā)明中，核酸擴增例如為rt-pcr。

47、在本發(fā)明中，核酸擴增例如為恒溫擴增，如cpa。