本發(fā)明涉及生物防治，尤其涉及一種銅綠假單胞菌·棘孢木霉復(fù)合微生物菌劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、辣椒是溫室大棚和露地主栽蔬菜作物之一。然而，隨著辣椒種植面積的增長和種植年限的延長，加上蔬菜種植種類相對(duì)單一、氣候條件變化、化肥農(nóng)藥過量使用、連作等不利因素影響，導(dǎo)致辣椒疫病等土傳病害和土壤連作障礙加重，已成為嚴(yán)重影響辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害之一。辣椒疫病的致病菌是辣椒疫霉菌(phytophthoracapsici)，其寄主廣泛，能夠侵染辣椒、番茄、黃瓜等多種作物，可以在土壤中長期存活，且病原菌積累到一定量后，可導(dǎo)致絕收，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2、不僅是辣椒作物，當(dāng)前，生產(chǎn)上對(duì)于辣椒疫病等土傳病害防治仍主要依賴于化學(xué)防治，而化學(xué)殺菌劑的長期大量使用引起了土壤水體污染加重、農(nóng)產(chǎn)品殘留超標(biāo)、病害抗藥性增強(qiáng)等諸多問題，導(dǎo)致土壤質(zhì)量和瓜菜品質(zhì)下降、經(jīng)濟(jì)效益降低，對(duì)土壤微生態(tài)環(huán)境影響較大，嚴(yán)重影響了瓜菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。尤其在當(dāng)前農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的時(shí)代背景下，瓜菜產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量和綠色發(fā)展更為重要。因此，微生物農(nóng)藥以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)已成為辣椒疫病等瓜菜土傳病害防治的主要內(nèi)容。與目前使用化學(xué)農(nóng)藥防治相比，由于生防菌來自于土壤或植株體，具有高效、低毒、不污染環(huán)境和不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

3、假單胞菌在自然界分布廣泛，種類繁多，廣泛分布于植物體及土壤中，是植物根際土壤周圍起生物防治功能的主要細(xì)菌類群。目前，世界各地對(duì)假單胞菌的應(yīng)用研究有了大量的報(bào)道，涉及領(lǐng)域包括用于農(nóng)業(yè)生物防治、植物生長調(diào)節(jié)、環(huán)境保護(hù)等方面。假單胞菌作為應(yīng)用廣泛的生防菌之一，可通過寄生、競(jìng)爭(zhēng)作用、次生代謝產(chǎn)物分泌及誘導(dǎo)植物抗性等方式抑制病原菌生長繁殖，達(dá)到降低病害發(fā)生、促進(jìn)植物生長發(fā)育及產(chǎn)物的積累，其生物防治主要作用對(duì)象為植物病原真菌。目前最常見運(yùn)用最廣泛的假單胞菌種類有熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)、丁香假單胞菌(pseudomonas?syringae)、綠針假單胞菌(pseudomonaschlororaphis)、銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)等。近年來，有關(guān)銅綠假單胞菌作物生物防治中應(yīng)用的發(fā)明專利主要以單一菌株為主(例如專利號(hào)為cn202111308578的專利)。而且在防治辣椒疫病中的應(yīng)用較少，尤其是復(fù)合生防菌株優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)防治辣椒疫病等瓜菜土傳病害方面的研究和應(yīng)用很少。

4、木霉屬(trichoderma?sp.)真菌在世界范圍內(nèi)分布廣泛，其既是土壤微生物的重要群落之一，也是一種植物內(nèi)生真菌，從土壤、植物根際、莖部、葉片、種子及球莖表面、枯枝落葉腐木等植物殘?bào)w以及其它真菌的子實(shí)體上等均可分離到?，F(xiàn)有研究資料表明，木霉菌在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、環(huán)境保護(hù)等方面有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值，其在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用表現(xiàn)尤為突出，現(xiàn)已有多種木霉菌生防菌劑、生物菌肥、誘抗劑、種子包衣劑等產(chǎn)品獲得登記和商業(yè)化生產(chǎn)并在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用。其中主要以哈茨木霉(trichoderma?harzianum)居多，其次為綠色木霉(trichoderma?viride)。相對(duì)于土壤木霉菌，內(nèi)生木霉菌的研究起步較晚，相關(guān)的報(bào)道較少，但由于內(nèi)生木霉菌可與寄主植物共生，在抗病、抗逆性、穩(wěn)定性等方面優(yōu)勢(shì)明顯，其自身的抗病、抗逆性較強(qiáng)等許多優(yōu)勢(shì)，目前越來越得到研究者的重視，開發(fā)和應(yīng)用潛力巨大。有關(guān)棘孢木霉單一菌株或與不同芽孢桿菌復(fù)配成菌劑的應(yīng)用相對(duì)較多，但棘孢木霉與假單胞菌復(fù)配的菌劑及其應(yīng)用很少(例如專利號(hào)為cn201210365179的專利)，更缺少在防治辣椒疫病應(yīng)用的復(fù)合微生物菌劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、解決的技術(shù)問題：針對(duì)現(xiàn)有的單一生防菌劑對(duì)辣椒疫病等防效較低、穩(wěn)定性較差等缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種銅綠假單胞菌·棘孢木霉復(fù)合微生物菌劑及其制備方法和應(yīng)用，該復(fù)合微生物菌劑能夠有效解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的辣椒疫病等土傳病害和連作障礙問題，且對(duì)辣椒等瓜菜植株促生長作用明顯。

2、技術(shù)方案：一種棘孢木霉·銅綠假單胞菌復(fù)合微生物菌劑，以質(zhì)量份計(jì)含有以下成分：

3、銅綠假單胞菌固體發(fā)酵物：31～42.5份，

4、棘孢木霉固體發(fā)酵物：31～42.5份，

5、助劑：13～30份，

6、增效劑：2～8份；

7、所述復(fù)合微生物菌劑中有效孢子數(shù)＞1010cfu/g；所述銅綠假單胞菌于2022年09月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，保藏編號(hào)為cgmccno.25697；所述棘孢木霉于2023年08月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，保藏編號(hào)為cgmcc?no.40752。

8、上述所述的助劑為白炭黑、麥麩中的一種或兩種。

9、上述所述的增效劑為殼寡糖、生化黃腐酸中的一種或兩種。

10、上述所述的一種銅綠假單胞菌·棘孢木霉復(fù)合微生物菌劑，以質(zhì)量份計(jì)含有以下成分：銅綠假單胞菌固體發(fā)酵物：31～42.5份，棘孢木霉固體發(fā)酵物：31～42.5份，白炭黑：3～10份，麥麩：10～20份，殼寡糖：1～3份，生化黃腐酸：1～5份。

11、上述所述的一種銅綠假單胞菌·棘孢木霉復(fù)合微生物菌劑，以質(zhì)量份計(jì)含有以下成分：銅綠假單胞菌固體發(fā)酵物：36.5份，棘孢木霉固體發(fā)酵物：36.5份，白炭黑：8份，麥麩：12份，殼寡糖：3份，生化黃腐酸：4份。

12、上述所述的一種銅綠假單胞菌·棘孢木霉復(fù)合微生物菌劑的制備方法，該方法的步驟如下：

13、步驟一、銅綠假單胞菌固體發(fā)酵物和棘孢木霉固體發(fā)酵物的制備：

14、1)將深層保存于-80℃的銅綠假單胞菌和棘孢木霉的菌株取出，分別制備得到銅綠假單胞菌種子發(fā)酵液和棘孢木霉種子發(fā)酵液，

15、2)將麥麩、玉米芯粉、玉米秸稈粉、水以重量比為15:9:6:70混合后，加入磷酸二氫鉀，在121℃條件下滅菌40min，得到固體發(fā)酵培養(yǎng)基，其中磷酸二氫鉀的重量為麥麩、玉米芯粉、玉米秸稈粉、水總重量的1％，

16、3)將銅綠假單胞菌種子發(fā)酵液與固體發(fā)酵培養(yǎng)基以重量比為1:7.5混合，攪拌均勻后用滅菌紙覆蓋，置于溫度為32℃、相對(duì)濕度為85％以上的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)3d，期間攪拌1～2次，發(fā)酵完畢后將其晾干或在32℃以下干燥，即得銅綠假單胞菌固體發(fā)酵物，置于陰涼處保存?zhèn)溆茫?/p>

17、4)將棘孢木霉種子發(fā)酵液與固體發(fā)酵培養(yǎng)基以重量比為1:7.5混合，攪拌均勻后用滅菌紙覆蓋，置于溫度為28℃、相對(duì)濕度為85％以上的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)5d，期間攪拌1～2次，發(fā)酵完畢后將其晾干或在32℃以下干燥，即得棘孢木霉固體發(fā)酵物，置于陰涼處保存?zhèn)溆茫?/p>

18、步驟二、復(fù)合微生物菌劑的制備：

19、將銅綠假單胞菌固體發(fā)酵物和棘孢木霉固體發(fā)酵物混合，再與白炭黑、麥麩、殼寡糖、生化黃腐酸進(jìn)行干混，其中麥麩預(yù)先用超細(xì)破碎機(jī)粉碎以及過100目篩，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蟮玫焦腆w粉狀物，測(cè)定其有效孢子數(shù)＞1010cfu/g，即得復(fù)合微生物菌劑。

20、上述所述的一種銅綠假單胞菌·棘孢木霉復(fù)合微生物菌劑在防治辣椒疫病、西瓜枯萎病中的應(yīng)用。

21、有益效果：本發(fā)明提供的一種銅綠假單胞菌·棘孢木霉復(fù)合微生物菌劑及其制備方法和應(yīng)用，具有以下有益效果：

22、1.本發(fā)明的銅綠假單胞菌和棘孢木霉菌株產(chǎn)孢量大，尤其是銅綠假單胞菌s11，產(chǎn)孢量達(dá)1014cfu/ml以上，且降解纖維素、固氮解鉀、耐高溫、耐鹽堿、抗紫外光能力均很強(qiáng)，而棘孢木霉可在植株體內(nèi)與寄主形成共生關(guān)系，兩種生防菌通過競(jìng)爭(zhēng)、重寄生、次生代謝產(chǎn)物分泌及誘導(dǎo)植物抗性等多種作用機(jī)制協(xié)同增效，可彌補(bǔ)單一菌劑使用的局限性。

23、2.本發(fā)明的復(fù)合微生物菌劑對(duì)辣椒疫病防病促生作用明顯，對(duì)瓜菜枯萎病、立枯病、早疫病、晚疫病、菌核病等病害的病原菌也有較好抑制作用，是一種廣譜性生物殺菌劑，其穩(wěn)定性強(qiáng)，既能防病促生，又能使作物根際土壤有益微生物大量增殖，改善土壤微生態(tài)環(huán)境。

24、3.本發(fā)明的復(fù)合微生物菌劑的助劑為白炭黑、麥麩，增效劑為殼寡糖、生化黃腐酸，其中增效劑可誘導(dǎo)作物提高抗病性，改良土壤。

25、4.本發(fā)明的復(fù)合微生物菌劑無污染，無公害，使用方法簡單，價(jià)格低廉，施用后可降低化學(xué)農(nóng)藥使用量和抗藥性，明顯減少病害發(fā)生，達(dá)到提質(zhì)增效的目的，促進(jìn)瓜菜產(chǎn)業(yè)的綠色發(fā)展，適合推廣應(yīng)用。