本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及表達(dá)dtmuv病毒樣顆粒的重組鴨瘟病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、鴨坦布蘇病毒(dtmuv)及其他的水禽tmuv均具有黃病毒屬性。因此，關(guān)于dtmuv疫苗的研制是非常迫切的。目前，已有商品化的dtmuv滅活疫苗(hb株)和減毒疫苗(wf100株)。這些疫苗各有優(yōu)缺點，滅活苗安全性高、但價格高，而減毒疫苗存在一定安全隱患。鴨瘟是鴨、鵝和其他雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。該病流行廣泛，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率都高，曾給禽類養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2、鴨瘟的防控目前主要靠傳統(tǒng)鴨瘟雞胚化弱毒活疫苗，鴨瘟弱毒疫苗在水禽生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用，具有免疫效果好、安全性高的特點，還能突破母源抗體的干擾。但不能區(qū)分免疫鴨和自然感染鴨，影響該病的免疫檢測及監(jiān)控。這也是疫苗研究工作者急需解決的問題。

3、鴨瘟病毒(dev)除了具有皰疹病毒特性之外，商品化的dev弱化疫苗株已被廣泛用于dev的防控。因此，dev是極佳的用于研發(fā)水禽疫苗的病毒載體候選者。迄今為止，研究者已嘗試以dev為載體，分別將傳染性法氏囊病病毒、鴨病毒性肝炎病毒i型和iii型、新城疫病毒、h5n1亞型禽流感病毒(aiv)、h5n6亞型aiv、h5n8亞型aiv、h9n2亞型aiv、dtmuv、鵝細(xì)小病毒、鵝h5亞型禽流感病毒的抗原基因插入至dev基因組中，用于研發(fā)相關(guān)的二聯(lián)疫苗。chen等分別將前綴信號肽tpas的dtmuv截短形式的e蛋白(te)和與prm串聯(lián)表達(dá)的e截短體(prm/te)插入到dev疫苗株基因組的us7/us8間，獲得了兩株重組鴨瘟病毒，該病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞能表達(dá)外源蛋白，并能誘導(dǎo)鴨體產(chǎn)生e蛋白抗體，經(jīng)過兩次免疫，rdev-prm/te能完全保護(hù)鴨免受dtmuv的攻擊，而rdev-te只能保護(hù)部分鴨子遭受dtmuv攻毒。該研究顯示，ttpa信號肽的加入增加了e蛋白的表達(dá)量及分泌型蛋白的產(chǎn)生。zou等以dev作為載體表達(dá)dtmuv全長e基因也取得了成功。重組病毒c-kce-e能保護(hù)鴨免于dev強(qiáng)毒攻擊，且能產(chǎn)生dtmuv?e蛋白中和性抗體。之后，zou等又同時將h5n1亞型禽流感病毒ha和dtmuvprm-e克隆至dev疫苗株基因組，獲得了重組病毒c-kce-ha/prm-e，該病毒能誘導(dǎo)部分鴨產(chǎn)生針對h5n1亞型aiv和dtmuv的中和性抗體，但同時也能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，接種重組病毒能保護(hù)鴨免于dev、h5n1亞型aiv和dtmuv強(qiáng)毒的攻擊。我們也經(jīng)過長期的研究構(gòu)建了表達(dá)不同形式dtmuv?e抗原的重組鴨瘟病毒，并對其表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，雖然這些研究取得了不錯的成績，但還沒有以鴨瘟病毒作為載體表達(dá)dtmuv病毒樣顆粒的報道。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了表達(dá)dtmuv病毒樣顆粒的重組鴨瘟病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，所述重組病毒能形成dtmuv病毒樣顆粒(vlps)，可以穩(wěn)定誘導(dǎo)鴨產(chǎn)生針對dtmuv?e蛋白的特異性抗體。

2、本發(fā)明提供了重組多核苷酸，包括依次連接的c基因、prm基因和截短的e基因；

3、所述c基因、prm基因和截短的e基因均來源于鴨坦布蘇病毒基因組，且在所述連接前以鴨為宿主進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。

4、在本發(fā)明一個具體實施方式中，經(jīng)密碼子優(yōu)化后的c基因的核苷酸序列包括seqid?no.1所示的序列；

5、經(jīng)密碼子優(yōu)化后的prm基因的核苷酸序列包括seq?id?no.2所示的序列。

6、在本發(fā)明一個具體實施方式中，所述截短的e基因包括僅保留1-451位氨基酸序列的截短的e基因；

7、所述截短的e基因的核苷酸序列包括seq?id?no.3所示的序列。

8、本發(fā)明提供了一種包含上述重組多核苷酸的重組質(zhì)粒。

9、在本發(fā)明一個具體實施方式中，所述重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)骨架質(zhì)粒包括pep-bgh-end質(zhì)粒。

10、本發(fā)明提供了上述重組多核苷酸或上述重組質(zhì)粒在構(gòu)建重組鴨瘟病毒中的應(yīng)用。

11、本發(fā)明提供了重組鴨瘟病毒突變體bac克隆的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

12、(1)將上述重組多核苷酸插入pep-bgh-end中，得重組質(zhì)粒pep-pcmv-cme451；

13、(2)以步驟(1)所述重組質(zhì)粒pep-pcmv-cme451為模板，利用引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將pcr擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)化至菌株感受態(tài)細(xì)胞中，篩選得到含kan標(biāo)記的重組克隆中間體ppcmv-kan.cme451；所述菌株感受態(tài)細(xì)胞為攜帶有鴨瘟病毒疫苗株感染性bac克隆(pdev-ef1，簡稱pe1)的菌株；所述引物對包括核苷酸序列如seq?id?no.4所示的上游引物和核苷酸序列如seq?id?no.5所示的下游引物；

14、(3)通過同源重組去除步驟(2)得到的所述重組克隆中間體ppcmv-kan.cme451的kan基因，構(gòu)建得到重組鴨瘟病毒突變體bac克隆。

15、本發(fā)明還提供了利用上述構(gòu)建方法得到的重組鴨瘟病毒突變體bac克隆。

16、本發(fā)明還提供了利用上述重組鴨瘟病毒突變體bac克隆經(jīng)拯救后得到的重組病毒。

17、本發(fā)明還提供了利用上述重組鴨瘟病毒突變體bac克隆或上述重組病毒制備得到的病毒樣顆粒。

18、本發(fā)明還提供了利用上述重組鴨瘟病毒突變體bac克隆、上述重組病毒或上述病毒樣顆粒在制備疫苗中的應(yīng)用。

19、在本發(fā)明一個具體實施方式中，所述疫苗包括二聯(lián)活疫苗。

20、本發(fā)明還提供了一種疫苗，包括上述重組鴨瘟病毒突變體bac克隆、上述重組病毒或上述病毒樣顆粒，和藥學(xué)上可接受的輔料。

21、有益效果：本發(fā)明提供了一種來源于鴨坦布蘇病毒基因組并以鴨為宿主進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的重組多核苷酸(cme451基因)，包括依次連接的c基因、prm基因和截短的e基因。本發(fā)明將所述重組多核苷酸插入到pep-bgh-end，構(gòu)建得到質(zhì)粒pep-pcmv-cme451。

22、本發(fā)明以pep-pcmv-cme451質(zhì)粒為模板，并通過“red?e/t兩步重組”獲得重組鴨瘟突變體bac克隆，如含kan標(biāo)記的重組bac克隆中間體ppcmv-kan.cme451；以及去除kan基因后只含有pcmv-cme451-bgh-pa表達(dá)框的重組子ppcmv-cme451。

23、本發(fā)明利用雞胚成纖維細(xì)胞(cefs)對ppcmv-cme451進(jìn)行拯救，拯救得到rpcmv-cme451。本發(fā)明所述rpcmv-cme451蝕斑面積較re1增加了46％；將rpcmv-cme451感染細(xì)胞后能檢測到相應(yīng)的dtmuv病毒e蛋白，顯示為三條條帶，疑似為外源蛋白裂解前后的含e451蛋白的條帶：cme451(81.31kda)、me451(68.03kda)和e451(49.06kda)。在透射電鏡下，rpcmv-cme451病毒感染cefs后，dtmuv?c-m-e451形成病毒樣顆粒(vlps)結(jié)構(gòu)；重組病毒rpcmv-cme451感染鴨能產(chǎn)生針對e蛋白的抗體，在第2次免疫1w時抗體陽轉(zhuǎn)率達(dá)到100％。