本發(fā)明屬于基因工程，具體涉及靶向敲除hla-g異構(gòu)體基因的基因編輯系統(tǒng)和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、人類白細(xì)胞抗原-g(human?leukocyte?antigen-g，hla-g)屬于非經(jīng)典的hla?i類分子，該基因位于第6號(hào)染色體6p21.3區(qū)，全長(zhǎng)約6.0kb。hla-g初始轉(zhuǎn)錄物經(jīng)選擇性剪接后至少產(chǎn)生7種信使rna(messengerrna,mrna)，分別編碼如圖1所示的至少7種蛋白質(zhì)異構(gòu)體分子，包括4種膜結(jié)合型hla-g1～-g4和3種可溶性hla-g5～-g7，以及新型的hla-g異構(gòu)體等。

2、在圖1所示的蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中，hla-g?mrna第1外顯子編碼信號(hào)肽(signalpeptides,sp)，第2、3和第4外顯子分別編碼細(xì)胞外區(qū)的α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域，第5位外顯子編碼跨膜區(qū)(transmembrane?region,tm)；第6外顯子編碼僅含6個(gè)氨基酸殘基的hla-g分子胞內(nèi)段；由于外顯子6內(nèi)含有終止密碼子(tga)，第7、第8外顯子對(duì)應(yīng)于hla-g基因的非翻譯區(qū)(3′-untranslatedregion,3′utr)。

3、hla-g1是由全長(zhǎng)hla-g?mrna編碼，結(jié)構(gòu)上類似于hlai類抗原，包含α1、α2、α3結(jié)構(gòu)域。hla-g2缺乏α2結(jié)構(gòu)域。hla-g3缺乏α2和α3結(jié)構(gòu)域。hla-g4缺乏α3結(jié)構(gòu)域。hla-g5及hla-g6胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域分別與hla-g1及hla-g2相同，但它們由含有內(nèi)含子4的hla-g?mrna編碼，因內(nèi)含子4中含有終止密碼子(taa)，所編碼的蛋白分子缺乏由外顯子5所編碼的跨膜區(qū)，形成可溶性hla-g分子。編碼hla-g7的mrna由于內(nèi)含子2中含有終止密碼子(taa)，胞外區(qū)僅含α1結(jié)構(gòu)域及由內(nèi)含子2所編碼的2個(gè)氨基酸殘基相連。hla-g1～-g7等異構(gòu)體的分子量約為39kd、31kd、23kd、30kd、37kd、27kd及17kd等。

4、相對(duì)于經(jīng)典的hlai類分子，hla-g具有獨(dú)特的啟動(dòng)子區(qū)域、基因多態(tài)性有限、嚴(yán)格的組織分布以及提呈抗原種類單一等特點(diǎn)。生理?xiàng)l件下，hla-g分子限制性分布于免疫豁免組織，如母胎界面的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞、胸腺、角膜、胰島等。臨床上，發(fā)現(xiàn)hla-g在病理組織中如腫瘤、器官移植、自身免疫疾病、炎癥、病毒感染等特異性表達(dá)上調(diào)；且hla-g表達(dá)量高低與腫瘤患者的臨床分期、預(yù)后、生存時(shí)間等密切相關(guān)。功能上，hla-g是機(jī)體內(nèi)一種重要的免疫耐受分子，可通過(guò)抑制免疫細(xì)胞功能或誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性細(xì)胞的產(chǎn)生，使腫瘤細(xì)胞逃逸宿主的免疫監(jiān)視，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

5、近幾年，hla-g逐漸被認(rèn)為是一種新型的免疫檢查點(diǎn)分子，推斷hla-g檢查點(diǎn)抑制劑與化療、放療或其他免疫靶點(diǎn)藥物的聯(lián)合治療將會(huì)給復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性腫瘤患者帶來(lái)更好的療效。目前，針對(duì)hla-g開(kāi)發(fā)的抗體或car-t藥物等尚處于早期的研究階段。而針對(duì)hla-g功能，大多數(shù)的研究主要集中在全長(zhǎng)的膜結(jié)合型分子hla-g1及其可溶性分子hla-g5，有關(guān)其他幾種hla-g異構(gòu)體分子的研究甚少，卻與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，如腎癌、胃癌等。根據(jù)不同的研究，hla-g異構(gòu)體在腫瘤發(fā)生中的作用仍存在爭(zhēng)議。再加上，在不同腫瘤組織細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)不同的hla-g異構(gòu)體表達(dá)存在廣泛的異質(zhì)性。因此，不同的hla-g異構(gòu)體可能具有特定的生物學(xué)功能及其臨床意義，使得研究除hla-g1、-g5之外的hla-g異構(gòu)體分子功能迫在眉睫。

6、目前除了hla-g1、-g5異構(gòu)體分子的生物學(xué)功能有被報(bào)道之外，hla-g2、-g3、-g4、-g6、-g7異構(gòu)體分子，包括新型hla-g異構(gòu)體分子的功能及意義仍未闡明。但是，目前尚未見(jiàn)通過(guò)何種技術(shù)成功對(duì)不同的hla-g異構(gòu)體基因?qū)崿F(xiàn)精準(zhǔn)敲除的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了靶向敲除hla-g異構(gòu)體基因的基因編輯系統(tǒng)和應(yīng)用，可以精準(zhǔn)敲除不同的hla-g異構(gòu)體基因或者完整性敲除整個(gè)hla-g基因，達(dá)到精準(zhǔn)敲除hla-g特定基因區(qū)域的目的。

2、本發(fā)明提供了敲除hla-g異構(gòu)體基因的sgrna組合，包括分別針對(duì)hla-g異構(gòu)體基因的基因結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的靶標(biāo)序列和互補(bǔ)序列；

3、所述基因結(jié)構(gòu)包括外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5、內(nèi)含子4和內(nèi)含子2。

4、優(yōu)選的，所述靶標(biāo)序列和互補(bǔ)序列的核苷酸序列依次如seq?id?no.1～seq?idno.14所示。

5、本發(fā)明提供了靶向敲除hla-g異構(gòu)體基因的crispr/cas9載體組合，包括由上述sgrna組合中針對(duì)各基因結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的靶標(biāo)序列和互補(bǔ)序列退火后形成的雙鏈序列與基因編輯載體連接構(gòu)建得到的crispr/cas9載體。

6、優(yōu)選的，所述基因編輯載體包括plenticrisprv2基因重組質(zhì)粒。

7、本發(fā)明提供了一種敲除hla-g異構(gòu)體基因的試劑盒，包括上述sgrna組合，或上述crispr/cas9載體組合。

8、優(yōu)選的，利用所述試劑盒敲除整個(gè)hla-g基因時(shí)，所述crispr/cas9載體組合包括：plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2、plenticrisprv2-e3、plenticrisprv2-e4、plenticrisprv2-e5、plenticrisprv2-i2和plenticrisprv2-i4；

9、其中，plenticrisprv2-e1為將針對(duì)外顯子1設(shè)計(jì)的靶標(biāo)序列和互補(bǔ)序列退火后形成的雙鏈序列與plenticrisprv2載體連接后構(gòu)建得到；

10、plenticrisprv2-e2為將針對(duì)外顯子2設(shè)計(jì)的靶標(biāo)序列和互補(bǔ)序列退火后形成的雙鏈序列與plenticrisprv2載體連接后構(gòu)建得到；

11、plenticrisprv2-e3為將針對(duì)外顯子3設(shè)計(jì)的靶標(biāo)序列和互補(bǔ)序列退火后形成的雙鏈序列與plenticrisprv2載體連接后構(gòu)建得到；

12、plenticrisprv2-e4為將針對(duì)外顯子4設(shè)計(jì)的靶標(biāo)序列和互補(bǔ)序列退火后形成的雙鏈序列與plenticrisprv2載體連接后構(gòu)建得到；

13、plenticrisprv2-e5為將針對(duì)外顯子5設(shè)計(jì)的靶標(biāo)序列和互補(bǔ)序列退火后形成的雙鏈序列與plenticrisprv2載體連接后構(gòu)建得到；

14、plenticrisprv2-i2為將針對(duì)內(nèi)含子2設(shè)計(jì)的靶標(biāo)序列和互補(bǔ)序列退火后形成的雙鏈序列與plenticrisprv2載體連接后構(gòu)建得到；

15、plenticrisprv2-i4為將針對(duì)內(nèi)含子4設(shè)計(jì)的靶標(biāo)序列和互補(bǔ)序列退火后形成的雙鏈序列與plenticrisprv2載體連接后構(gòu)建得到。

16、優(yōu)選的，利用所述試劑盒敲除膜結(jié)合型hla-g1基因的載體組合包括：plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2、plenticrisprv2-e3、plenticrisprv2-e4和plenticrisprv2-e5；

17、利用所述試劑盒敲除膜結(jié)合型hla-g2基因的載體組合包括:plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2、plenticrisprv2-e4和plenticrisprv2-e5；

18、利用所述試劑盒敲除膜結(jié)合型hla-g3基因的載體組合包括:plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2和plenticrisprv2-e5；

19、利用所述試劑盒敲除膜結(jié)合型hla-g4基因的載體組合包括:plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2、plenticrisprv2-e3和plenticrisprv2-e5；

20、利用所述試劑盒敲除可溶性hla-g5基因的載體組合包括:plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2、plenticrisprv2-e3、plenticrisprv2-e4和plenticrisprv2-i4；

21、利用所述試劑盒敲除可溶性hla-g6基因的載體組合包括:plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2、plenticrisprv2-e4和plenticrisprv2-i4；

22、利用所述試劑盒敲除可溶性hla-g7基因的載體組合包括:plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2和plenticrisprv2-i2。

23、優(yōu)選的，利用所述試劑盒敲除缺失α1的hla-g基因的載體組合包括:plenticrisprv2-e3、plenticrisprv2-e4和plenticrisprv2-e5；

24、利用所述試劑盒敲除缺失α1和α2的hla-g基因的載體組合包括:plenticrisprv2-e4和plenticrisprv2-e5。

25、本發(fā)明還提供了靶向敲除hla-g異構(gòu)體基因的crispr/cas9慢病毒試劑盒，包括靶向敲除不同hla-g異構(gòu)體基因的crispr/cas9慢病毒系統(tǒng)；

26、所述crispr/cas9慢病毒系統(tǒng)的制備方法，包括分別使用慢病毒包裝質(zhì)粒對(duì)上述crispr/cas9載體組合中的每個(gè)crispr/cas9載體進(jìn)行包裝，轉(zhuǎn)染人源細(xì)胞后，得到靶向敲除不同hla-g異構(gòu)體基因的crispr/cas9慢病毒系統(tǒng)。

27、本發(fā)明還提供了上述sgrna組合、上述crispr/cas9載體組合、上述試劑盒或上述crispr/cas9慢病毒試劑盒在制備以hla-g為治療靶點(diǎn)的藥物中的應(yīng)用。

28、有益效果：本發(fā)明依據(jù)人的hla-g基因序列設(shè)計(jì)得到可精準(zhǔn)靶向hla-g基因的第1外顯子(sp)、第2外顯子(α1)、第3外顯子(α2)、第4外顯子(α3)、第5外顯子(tm)、第2內(nèi)含子以及第4內(nèi)含子的一段引導(dǎo)rna(small?guide?rna,sgrna)。

29、本發(fā)明通過(guò)針對(duì)hla-g基因的各結(jié)構(gòu)的靶序列和互補(bǔ)序列經(jīng)退火后形成雙鏈片段，將所述雙鏈片段插入到基因編輯載體中，構(gòu)建得到針對(duì)整體hla-g基因、膜結(jié)合型hla-g1～-g4基因、可溶性hla-g5～-g7基因以及新型hla-g基因的crispr/cas9基因編輯載體組合。

30、本發(fā)明結(jié)合慢病毒載體的高效轉(zhuǎn)染特性和crispr/cas9技術(shù)的高效基因編輯特征，利用慢病毒對(duì)所述crispr/cas9基因編輯載體組合分別進(jìn)行包裝，可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)敲除不同的hla-g異構(gòu)體基因或者完整性敲除hla-g基因，包括新型異構(gòu)體，本發(fā)明為今后探索不同hla-g異構(gòu)體分子的功能，和推動(dòng)hla-g免疫抑制劑的研發(fā)及其在免疫治療效果評(píng)價(jià)中均具有非常重要的意義。