本技術(shù)涉及中藥分析，特別涉及一種引物對、試劑盒和不同基原的百部中藥原植物、藥材或飲片的鑒別方法。

背景技術(shù)：

1、《中國藥典》2020年版規(guī)定百部為百部科植物直立百部stemona?sessilifolia（miq.）miq.、蔓生百部stemona?japonica（bl.）miq.或?qū)θ~百部stemona?tuberosa?lour.的干燥塊根。春、秋二季釆挖，除去須根，洗凈，置沸水中略燙或蒸至無白心，取出，曬干。百部甘、苦，微溫。歸肺經(jīng)。主治潤肺下氣止咳，殺蟲滅虱。用于新久咳嗽，肺癆咳嗽，頓咳；外用于頭虱，體虱，蟯蟲病，陰癢。

2、據(jù)《中國藥典》2020年版收載，百部屬于多基原中藥，不同品種、產(chǎn)地，其主要化學(xué)成分的種類和含量有一定的差異。此外，不同基原間外觀性狀相似，尤其加工成飲片后，單從外部形態(tài)學(xué)上難以區(qū)別，在銷售過程中，極易造成基原混用，因此，準(zhǔn)確鑒別不同基原的百部十分必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于此，本技術(shù)第一方面提供一種引物對，其技術(shù)方案如下：

2、一種引物對，包括序列如seq?id?no：1所示的上游引物和序列如seq?id?no：2所示下游引物。

3、本技術(shù)第二方面提供一種試劑盒，其技術(shù)方案如下：

4、一種試劑盒，包括如上所述的引物對。

5、可選地，所述試劑盒還包括擴(kuò)增試劑，所述擴(kuò)增試劑包括pcr擴(kuò)增緩沖液、脫氧核苷三磷酸（dntps）和dna聚合酶中的一種或多種。

6、可選地，所述pcr擴(kuò)增緩沖液選自10×buffer。

7、可選地，dna聚合酶選自ex?taq。

8、可選地，所述pcr擴(kuò)增緩沖液、脫氧核苷三磷酸（dntps）和dna聚合酶的體積比為（2~3）：（1.5~2.5）：0.2。例如，所述pcr擴(kuò)增緩沖液、脫氧核苷三磷酸（dntps）和dna聚合酶的體積比為2：1.5：0.2、2.5：2：0.2、3：2.5：0.2。

9、本技術(shù)第三方面提供一種不同基原的百部中藥原植物、藥材或飲片的鑒別方法，其技術(shù)方案如下：

10、一種不同基原的百部中藥原植物、藥材或飲片的鑒別方法，包括以下步驟：

11、以待測樣品的基因組dna為模板，采用權(quán)利要求1所述的引物對或權(quán)利要求2或3所述的試劑盒進(jìn)行pcr擴(kuò)增，對所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，并根據(jù)所得檢測結(jié)果鑒別百部中藥原植物、藥材或飲片的基原。

12、當(dāng)待測樣品為百部中藥原植物，根據(jù)上述方法可鑒別百部中藥原植物的基原。當(dāng)待測樣品為百部藥材，根據(jù)上述方法可鑒別百部藥材的基原。當(dāng)待測樣品為百部飲片，根據(jù)上述方法可鑒別百部飲片的基原。

13、其中，可鑒別的百部中藥原植物的基原包括對葉百部、直立百部和蔓生百部?？设b別的百部藥材的基原包括對葉百部、直立百部和蔓生百部?？设b別的百部飲片的基原包括對葉百部、直立百部和蔓生百部。

14、可選地，檢測的方法包括熒光毛細(xì)管str分型法。短串聯(lián)重復(fù)序列（short?tandemrepeats，str）分型技術(shù)是一種利用pcr擴(kuò)增長度差異進(jìn)行分型，比較鑒別個(gè)體生物的dna分析技術(shù)，該技術(shù)是目前應(yīng)用比較廣泛的遺傳標(biāo)記，包括法醫(yī)鑒定、基因定位、分子分型、遺傳制圖等等。本技術(shù)建立一種基于str分型的百部dna指紋圖譜鑒別方法。

15、可選地，根據(jù)所得檢測結(jié)果鑒別百部中藥原植物、藥材或飲片的基原，包括以下步驟：

16、若片段str分型遷移峰為371bp~373bp，則待測樣品的基原為對葉百部；

17、若片段str分型遷移峰為374bp~376bp，則待測樣品的基原為直立百部；

18、若片段str分型遷移峰為398bp~400bp，則待測樣品的基原為蔓生百部。

19、其中，若片段str分型遷移峰為371bp、372bp、373bp，則待測樣品的基原為對葉百部；若片段str分型遷移峰為374bp、375bp、376bp，則待測樣品的基原為直立百部；若片段str分型遷移峰為398bp、399bp、400bp，則待測樣品的基原為蔓生百部。

20、可選地，混合所述上游引物、下游引物、擴(kuò)增試劑和待測樣品的基因組dna，得到pcr擴(kuò)增的初始反應(yīng)體系；

21、按照擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增。

22、可選地，pcr擴(kuò)增的擴(kuò)增程序包括：于93℃~97℃下預(yù)變性3min~7min，再循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)31~37次，再于70℃~74℃下延伸3min~7min；

23、所述循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的程序包括：于93℃~97℃下變性25s~35s，再于50℃~58℃下退火25s~35s，再于70℃~74℃下延伸25s~35s。

24、其中，于93℃~97℃下預(yù)變性3min~7min。例如，于93℃、94℃、95℃、96℃、97℃下預(yù)變性3min、4min、5min、6min、7min。

25、循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)31~37次。例如，循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)31次、32次、33次、34次、35次、36次、37次。

26、所述循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的程序包括：于93℃~97℃下變性25s~35s，再于50℃~58℃下退火25s~35s，再于70℃~74℃下延伸25s~35s。例如，所述循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的程序包括：于93℃、94℃、95℃、96℃、97℃下變性25s、27s、29s、31s、33s、35s，再于50℃、52℃、54℃、56℃、58℃下退火25s、27s、29s、31s、33s、35s，再于70℃、71℃、72℃、73℃、74℃下延伸25s、27s、29s、31s、33s、35s。

27、循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)后，于70℃~74℃下延伸3min~7min。例如，循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)后，于70℃、71℃、72℃、73℃、74℃下延伸3min、4min、5min、6min、7min。

28、可選地，所述pcr擴(kuò)增的初始反應(yīng)體系中，所述上游引物的濃度為0.01μmol/l~0.2μmol/l。例如，所述上游引物的濃度為0.01μmol/l、0.05μmol/l、0.1μmol/l、0.2μmol/l。

29、可選地，所述pcr擴(kuò)增的初始反應(yīng)體系中，所述下游引物的濃度為0.01μmol/l~0.2μmol/l。例如，所述下游引物的濃度為0.01μmol/l、0.05μmol/l、0.1μmol/l、0.2μmol/l。

30、可選地，所述擴(kuò)增試劑包括pcr擴(kuò)增緩沖液、脫氧核苷三磷酸和dna聚合酶中的一種或多種。

31、可選地，所述pcr擴(kuò)增緩沖液選自10×buffer。

32、可選地，dna聚合酶選自ex?taq。

33、可選地，所述pcr擴(kuò)增緩沖液、脫氧核苷三磷酸（dntps）和dna聚合酶的體積比為（2~3）：（1.5~2.5）：0.2。例如，所述pcr擴(kuò)增緩沖液、脫氧核苷三磷酸（dntps）和dna聚合酶的體積比為2：1.5：0.2、2.5：2：0.2、3：2.5：0.2。

34、可選地，所述pcr擴(kuò)增的初始反應(yīng)體系中，所述擴(kuò)增試劑的體積占比為0.05%~0.5%。例如，所述擴(kuò)增試劑的體積占比為0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。

35、可選地，所述pcr擴(kuò)增的初始反應(yīng)體系中，所述待測樣品的基因組dna的濃度不超過200ng/μl。可選地，所述待測樣品的基因組dna的濃度為10ng/μl~200ng/μl。

36、與傳統(tǒng)方案相比，本技術(shù)具有以下有益效果：

37、本技術(shù)設(shè)計(jì)了能夠快速區(qū)分不同基原（對葉百部、直立百部、蔓生百部）百部的特異性引物對，適用于百部不同基原的混偽鑒定，有利于保障中藥用藥安全與臨床療效。