本發(fā)明涉及一種α-淀粉酶突變體，尤其涉及一種ph耐受性增強(qiáng)的α-淀粉酶突變體，屬于生物工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡糖苷水解酶，ec?3.2.1.1)是一種內(nèi)切糖苷水解酶，能夠水解淀粉分子內(nèi)部的α-1,4糖苷鍵，生成糊精、低聚糖、麥芽三糖、麥芽糖和少量葡萄糖。在α-淀粉酶的作用下，淀粉發(fā)生降解、粘度下降，即完成液化。在諸多領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用體現(xiàn)了α-淀粉酶的重要性，例如：在制糖業(yè)中用于淀粉糊化和糖漿生產(chǎn)、在紡織工業(yè)中用于紙張退漿、在資源回收利用領(lǐng)域中用于將農(nóng)業(yè)廢料生產(chǎn)為動(dòng)物飼料或生物燃料、在制藥和化學(xué)行業(yè)中用于分析檢測(cè)、城市污水凈化等。目前，工業(yè)上主要通過(guò)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)α-淀粉酶。微生物衍生的α-淀粉酶主要來(lái)自解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，其產(chǎn)生的α-淀粉酶的最適ph為5.0-6.0。當(dāng)酶溶液在該ph范圍以外的條件下催化淀粉水解時(shí)，酶活性較低甚至失活。因此對(duì)α-淀粉酶進(jìn)行人工改造，以提高其在極端條件下的穩(wěn)定性，成為α-淀粉酶的重要研究方向。

2、酸性α-淀粉酶是指在較低的ph條件下可保持較高活性的一類α-淀粉酶，其最適ph值通常在4.0到5.0之間。這種特性使耐酸性α-淀粉酶在食品加工、醫(yī)藥、能源等特定應(yīng)用場(chǎng)景中的表現(xiàn)優(yōu)于普通α-淀粉酶，展示出其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。例如在青貯飼料、發(fā)酵飲料、藥物生產(chǎn)以及工業(yè)副產(chǎn)品的加工等領(lǐng)域，耐酸性α-淀粉酶能夠簡(jiǎn)化淀粉的加工工藝，使液化和糖化等過(guò)程在相同ph條件下進(jìn)行，從而避免傳統(tǒng)工藝中調(diào)整ph值的復(fù)雜過(guò)程，有助于提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。又例如在白酒釀造中，耐酸性α-淀粉酶能夠充分利用剩余淀粉，從而提高原料的利用率和出酒率，降低生產(chǎn)成本。

3、目前獲得酸性α-淀粉酶的方法包括對(duì)酸性α-淀粉酶進(jìn)行基因改造、對(duì)高產(chǎn)酸性α-淀粉酶的菌株進(jìn)行選育以及優(yōu)化發(fā)酵生產(chǎn)酸性α-淀粉酶的條件等。中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)cn114457058a公開(kāi)了一種飼用α淀粉酶的突變改良方法及應(yīng)用，該發(fā)明以貝萊斯芽孢桿菌(b.velezensis)α-淀粉酶為模板構(gòu)建了一系列新的α-淀粉酶突變體，具體包括第546、572、614、622號(hào)位突變，分別為由脯氨酸突變?yōu)楣劝彼?，組氨酸突變?yōu)樘於彼?，丙氨酸突變?yōu)楣劝彼?，賴氨酸突變?yōu)楣劝彼?，所述α淀粉酶變體在ph2.5-5.5酸性條件下和80℃以上高溫條件下有較高的催化活度。開(kāi)發(fā)更多的耐酸性α-淀粉酶有利于滿足高效高質(zhì)量水解淀粉的產(chǎn)業(yè)需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供了一種耐酸性的α-淀粉酶突變體，所述突變體在酸性條件下具有較高的酶活，并提供了編碼所述突變體的核酸分子、包含所述突變體的載體或重組細(xì)胞或產(chǎn)品，以及所述突變體的制備方法與應(yīng)用。

2、技術(shù)方案：本發(fā)明的第一方面提供一種耐酸性的α-淀粉酶突變體，所述α-淀粉酶突變體的氨基酸序列由如seq?id?no.1所示序列經(jīng)突變得到，所述突變?yōu)閟242e、n569e、n605d中至少一種。

3、本發(fā)明將來(lái)自貝萊斯芽孢桿菌(bacillus?velezensis)的α-淀粉酶作為原始酶，選擇蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中，位于蛋白質(zhì)表面的loop環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，突變?yōu)樗嵝园被?。?jīng)篩選，發(fā)現(xiàn)將α-淀粉酶第242位、第569位或第605位的氨基酸突變?yōu)樗嵝园被?，增加了表面?fù)電荷，提高了酶突變體的耐酸性。

4、本發(fā)明使用氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母與標(biāo)準(zhǔn)的取代記法：s242e意指n端第242位的絲氨酸(s)突變?yōu)楣劝彼?e)；n605d/s242e意指n端第605位的天冬酰胺(n)突變?yōu)樘於彼?d)，并且n端第242位的絲氨酸(s)突變?yōu)楣劝彼?e)。

5、第二方面，本發(fā)明提供一種核酸分子，所述核酸分子編碼第一方面所述的α-淀粉酶突變體。所述核酸分子能夠表達(dá)所述耐酸性的α-淀粉酶突變體。

6、進(jìn)一步的，所述核酸分子的核苷酸序列由如seq?id?no.2所示序列經(jīng)堿基突變得到。

7、第三方面，本發(fā)明提供一種載體，包含第二方面所述的核苷酸序列。所述載體能夠擴(kuò)增或表達(dá)所述核苷酸序列。

8、進(jìn)一步的，所述載體包括克隆載體或表達(dá)載體。載體可以為質(zhì)?；虿《镜?。

9、第四方面，本發(fā)明提供一種重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞包含第三方面所述的載體。

10、第五方面，本發(fā)明提供一種第一方面所述α-淀粉酶突變體的制備方法，包括如下步驟：

11、(1)以α-淀粉酶基因?yàn)槟０澹命c(diǎn)突變引物進(jìn)行pcr反應(yīng)得到α-淀粉酶突變基因；

12、(2)將α-淀粉酶突變基因插入表達(dá)載體，后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中獲得重組細(xì)胞；

13、(3)收集表達(dá)α-淀粉酶突變體的重組細(xì)胞，重懸菌體后破碎細(xì)胞，離心取上清即得含有α-淀粉酶突變體的粗酶液。

14、所述制備方法得到的α-淀粉酶突變體具有良好的酸穩(wěn)定性。

15、進(jìn)一步的，在(2)中，使用dna同源重組方法將α-淀粉酶突變基因插入表達(dá)載體。

16、優(yōu)選地，通過(guò)計(jì)算機(jī)建模，預(yù)測(cè)出原始α-淀粉酶的3d模型，并設(shè)計(jì)相關(guān)突變位點(diǎn)的引物。所述點(diǎn)突變引物如表1：

17、表1點(diǎn)突變引物

18、 引物名稱 序列(5’-3’) s242e-f caacacggaagcggaatttcagtatggcgaaattc s242e-r gaaattccgcttccgtgttggtaatgttcggccaaaac n569e-f tcaggaaccggatcattggggccaagtgaacgc n569e-r caatgatccggttcctgatagccaataatgttgg n605d-f cgcggatggcatgtataccctgaccctgccggc n605d-r gtatacatgccatccgcgtttttggtcatcgctttg

19、引物中下劃線標(biāo)記的為突變位點(diǎn)

20、所述pcr反應(yīng)的體系如表2：

21、表2pcr反應(yīng)體系

22、

23、pcr反應(yīng)的條件如表3：

24、表3pcr反應(yīng)條件

25、

26、第六方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包含第一方面所述的α-淀粉酶突變體或第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的載體或第四方面所述的重組細(xì)胞。

27、第七方面，本發(fā)明提供一種第六方面所述產(chǎn)品在催化淀粉水解中的應(yīng)用。

28、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明提供的α-淀粉酶突變體具有良好的酸穩(wěn)定性，在ph?1.9-4.0之間，酶突變體催化淀粉水解的能力均有明顯提升；在ph為1.9時(shí)，酶突變體的比酶活相比原始酶提高了217.8％；2、本發(fā)明增加了α-淀粉酶在更寬的ph條件下的可用性，對(duì)提高淀粉加工產(chǎn)業(yè)中的原料利用率和產(chǎn)品質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本具有顯著效果，滿足了能源、食品和飼料等領(lǐng)域中對(duì)于耐酸性α-淀粉酶的需求，具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益，應(yīng)用前景廣闊。