本發(fā)明涉及體外診斷，具體而言，涉及一種基于人ctnnb1基因19種突變的檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

1、ctnnb1位于3號染色體上，編碼β-catenin蛋白，β-catenin介導(dǎo)細胞間粘附，作為經(jīng)典wnt信號通路的中心樞紐，是細胞內(nèi)wnt信號傳導(dǎo)的多功能蛋白。ctnnb1基因突變通常發(fā)生在外顯子3的基因區(qū)域，集中于32～37密碼子，通常每個患者只會發(fā)生其中一個堿基的突變，偶有兩種突變。這種由單個堿基的突變導(dǎo)致的β-catenin氨基酸改變會阻止β-catenin分解，從而使其在細胞內(nèi)積聚，過量的β-catenin進入細胞核并促進細胞不受限制的增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

2、研究表明，ctnnb1基因突變與多種腫瘤疾病相關(guān)，包括髓母細胞瘤、非小細胞肺癌及肝癌。而不同ctnnb1基因突變狀態(tài)在臨床上對醫(yī)生判斷患者的腫瘤進展、預(yù)后、個性化用藥等極其重要，因此檢測ctnnb1突變狀態(tài)對于患者制定個性化的治療方案具有重要意義。

3、對于當前的分子診斷技術(shù)來說，使用易于獲取的儀器同時實現(xiàn)靈敏的檢測，尤其是對低頻突變的準確檢測及定量一直是一個挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的侵入性組織活檢是目前腫瘤診斷的金標準，但受限于腫瘤的高度異質(zhì)性；非侵入性液體活檢能夠以良好的一致性分析腫瘤基因組，但受限于ctdna的含量低、高度碎片化、與大量野生型dna共存。腫瘤的高度異質(zhì)性以及大量高濃度野生型背景信號的干擾，是影響低豐度突變檢測靈敏度的主要因素，因此需要開發(fā)一種高度靈敏的檢測技術(shù)，來滿足低質(zhì)量臨床樣本或者微量樣本的檢測需求，如福爾馬林固定石蠟包埋組織樣本(ffpe樣本)或者穿刺樣本(ctdna)。

4、基于taqman探針的實時熒光定量pcr(quantitative?real-time?pcr，qpcr)技術(shù)作為目前的主流基因突變檢測技術(shù)，能夠檢出低至1％的突變含量，一般能夠滿足腫瘤組織樣本的臨床檢測需求，但是無法精確定量基因的突變頻率、還可能受到非特異擴增的影響。數(shù)字pcr(digital?pcr,dpcr)實現(xiàn)了“單分子模板擴增”的絕對定量，可以檢測和定量vaf低至0.01％的低頻突變，在檢測珍貴樣本和存在降解的樣本時具有明顯的優(yōu)勢，極其適合應(yīng)用于液體活檢，但dpcr通量有限，無法在一次反應(yīng)中檢測大量靶標。

5、鎖核酸(locked?nucleic?acid，lna)是具有固定n型構(gòu)象的雙環(huán)核苷類似物，其中一個核糖核苷通過一個亞甲基單元連接在2號氧和4號碳之間，和dna一樣也遵守watson-crick的堿基配對原則。koshkin等人的模型構(gòu)建表明lna單體被鎖定在n型構(gòu)象中，因此單鏈lna寡核苷酸被預(yù)先組織成a型螺旋結(jié)合互補序列，在lna-dna雙鏈形成時產(chǎn)生a型螺旋。核酸雙鏈的穩(wěn)定性受堿基對中氫鍵和堿基堆積相互作用(如疏水和靜電相互作用)的影響，由于距離較短，a型螺旋可能具有更強的堿基堆積相互作用，增強的堿基堆積相互作用提高了tm值。因此，lna-dna雜交體與其對應(yīng)的dna-dna相比，其tm會大幅升高，當lna摻入在寡核苷酸的特定位置時，完美匹配和錯配之間的lna-dna的tm值存在顯著差異。由于上述優(yōu)異的特性，lna技術(shù)被廣泛應(yīng)用于分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，例如基因突變的檢測。通過使用特異的lna修飾的探針，顯著降低了野生型等位基因的擴增效率，從而使突變基因得到富集和靈敏檢出。2010年barbara?denys等人開發(fā)了一種lna-qpcr方法，使用lna修飾的野生型阻滯探針和雙標記水解探針，靈敏且特異地檢測低至0.4％的jak2v617f突變。2012年daphne?ang等人使用競爭性lna阻滯探針部分抑制野生型pik3ca外顯子9或外顯子20序列的擴增，在小樣本或混合樣本中檢測pik3ca熱點突變，與標準sanger測序相比，該技術(shù)靈敏度大大提高，在0.6％到2.5％之間。

6、雖然已有一些專利提出了ctnnb1突變檢測方法，但是均存在突變位點覆蓋不全、耗時長、成本高的共性問題，不能在一管內(nèi)快速檢測ctnnb1常見的19種突變類型。同時，目前鮮有將競爭性lna阻滯探針用于ctnnb1的突變檢測，且目前l(fā)na阻滯探針的長度通常比較短(<16bp)，常規(guī)的阻滯探針無法覆蓋ctnnb1外顯子3的所有突變位點。

7、鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種人ctnnb1基因19種突變的檢測試劑盒，該試劑盒的lna阻滯探針能夠覆蓋ctnnb1三號外顯子上8個突變位點包含的19種突變類型，達到在一管反應(yīng)內(nèi)同時檢測人ctnnb1基因19種突變的效果，具有高特異性、高靈敏度、低成本的特點。

2、由于現(xiàn)有的人ctnnb1基因突變檢測方法大多只針對少數(shù)熱點突變，未能全面覆蓋d32～s37的常見突變類型，或者是需要多管反應(yīng)才能實現(xiàn)對多個突變的檢測。此外，由于腫瘤樣本中的大量野生型序列對檢測存在干擾，常規(guī)的pcr技術(shù)很難實現(xiàn)在大量野生型模板背景下對低頻突變的有效檢測及定量，也不能計算基因的突變頻率，致使靈敏度和特異性無法滿足檢測的需求?；谝陨霞夹g(shù)缺陷，本發(fā)明設(shè)計了一種lna修飾的長阻滯探針，并與taqman熒光探針相結(jié)合，建立了熒光pcr和數(shù)字pcr檢測技術(shù)體系。該lna探針可覆蓋ctnnb1三號外顯子上8個突變位點包含的19種突變類型，通過對野生型dna分子的特異性阻滯，實現(xiàn)對突變型dna分子的高效富集，從而大大增加了對稀有突變dna的檢測靈敏度。本發(fā)明的檢測體系可在一管內(nèi)同時實現(xiàn)對上述19種突變的檢測和定量，增加了檢測的靈敏度和特異性，彌補了以往檢測技術(shù)的不足。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種檢測人ctnnb1基因19種突變的核酸組合物，其包括引物、taqman探針和lna阻滯探針。

4、檢測的突變位點為人ctnnb1基因的熱點突變，如圖1所示，包括：c.94g>t，p.d32y；c.94g>c，p.d32h；c.94g>a，p.d32n；c.95a>c，p.d32a；c.95a>t，p.d32v；c.95a>g，p.d32g；c.97t>c，p.s33p；c.97t>g，p.s33a；c.98c>t，p.s33f；c.98c>g，p.s33c；c.98c>a，p.s33y；c.100g>a，p.g34r；c.100g>c，p.g34r；c.101g>a，p.g34e；c.101g>t，p.g34v；c.109t>c，p.s37p；c.110c>a，p.s37y；c.110c>g，p.s37c；c.110c>t，p.s37f。

5、其中，引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如seq?id?no:1所示，反向引物的核苷酸序列如seq?id?no:2所示；taqman探針的核苷酸序列如seq?id?no:3所示；lna阻滯探針的核苷酸序列如seq?id?no:4所示。

6、在本發(fā)明中，lna阻滯探針的長度為23bp，相比于常規(guī)的lna阻滯探針(<16bp)，長lna阻滯探針能夠覆蓋ctnnb1三號外顯子19種突變。利用本發(fā)明的長lna修飾阻滯探針對突變模板進行富集，阻滯野生型模板擴增，不同突變型模板比野生型模板優(yōu)先擴增1000～65000倍，增加了檢測的靈敏度和特異性，可實現(xiàn)在一個反應(yīng)管內(nèi)同時對19種突變類型的檢測。

7、本發(fā)明檢測人ctnnb1基因19種突變的引物、taqman探針和lna阻滯探針的擴增原理如圖2所示。

8、上述lna阻滯探針在設(shè)計時，突變位點的堿基用lna修飾，修飾個數(shù)為8個堿基，3’端添加一個氨基(nh2c7)以防延伸，lna阻滯探針和野生型模板序列完全互補配對，與突變型模板存在一個堿基的錯配。正是由于錯配使得lna阻滯探針與突變型模板結(jié)合的tm值降低，理想狀況下的tm值大小關(guān)系為：tmlna-wt>tmf-mut/wt>tmlna-mut(其中wt為野生型模板，mut為突變型模板)，這樣才可以保證在退火過程中l(wèi)na阻滯探針優(yōu)先與野生型模板結(jié)合阻滯其擴增，隨后前引物(即正向引物)優(yōu)先于lna阻滯探針與突變模板結(jié)合使其擴增。前引物的3’端和lna阻滯探針的5’端在突變位點前存在4bp重疊，一方面通過與前引物競爭性結(jié)合模板來實現(xiàn)對突變型模板富集，對野生型模板進行阻滯，另一方面為了防止lna阻滯探針被dna聚合酶水解。

9、如圖2所示，taqman探針位于lna阻滯探針下游，與其互補的序列不應(yīng)含有任何可能的突變，當模板是野生型基因時，由于lna阻滯探針具有高親和性和較高的tm值，會優(yōu)先于前引物與模板發(fā)生堿基互補配對，前引物的3’端無法與模板結(jié)合并翹起，dna聚合酶不能結(jié)合延伸，位于lna阻滯探針下游的taqman探針不能被水解發(fā)出熒光，儀器就無法檢測到熒光信號。相反，當模板是突變型序列時，lna阻滯探針與模板結(jié)合的tm值明顯下降，低于引物與模板結(jié)合的tm值，且lna阻滯探針與錯配堿基結(jié)合的熱穩(wěn)定性大大降低，因此退火過程中引物競爭性地結(jié)合到模板上，聚合酶識別3’oh延伸，水解下游taqman探針釋放熒光基團，從而收集到熒光信號，lna修飾位點所對應(yīng)的模板鏈發(fā)生任意基因的突變都可檢測到。

10、在一些實施例中核酸組合物中還包括內(nèi)參引物和內(nèi)參探針；內(nèi)參引物包括上游內(nèi)參引物和下游內(nèi)參引物，上游內(nèi)參引物的核苷酸序列如seq?id?no:5所示，下游內(nèi)參引物的核苷酸序列如seq?id?no:6所示；內(nèi)參探針的核苷酸序列如seq?id?no:7所示。

11、上述內(nèi)參基因選取為ctnnb1第十五外顯子中一段未發(fā)生突變且無snp的序列，針對這一序列設(shè)計上下游引物和taqman探針。在本發(fā)明中，設(shè)計內(nèi)參基因的檢測引物和taqman探針主要是為了對檢測體系進行質(zhì)控；同時，內(nèi)參基因也可視為樣本中野生型和突變型模板量的總和。在qpcr體系中根據(jù)靶標ct值與基因突變頻率vaf(variant?allelfrequency)的線性關(guān)系建立vaf的標準曲線，定量樣本vaf，在數(shù)字pcr體系中根據(jù)靶標軟件分析值(表示在16μl反應(yīng)體系中每微升含有的模板拷貝數(shù))與內(nèi)參軟件分析值的比值精確定量樣本vaf。

12、在一些實施例中，taqman探針和內(nèi)參探針的5’端各自標記有熒光報告基團，3’端各自標記有熒光淬滅基團；其中，熒光報告基團可以為fam、vic、rox和tamra中任意一種，熒光淬滅基團可以為bhq1、bhq2和bhq3中任意一種。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實際需要對熒光報告基團和熒光淬滅基團進行常規(guī)替換。

13、第二方面，本發(fā)明還提供了上述核酸組合物在制備熒光定量pcr和數(shù)字pcr檢測人ctnnb1基因19種突變的試劑盒中的應(yīng)用。

14、第三方面，本發(fā)明還提供了一種基于人ctnnb1基因19種突變的檢測試劑盒，其包含上述核酸組合物。

15、上述核酸組合物可制備為熒光定量pcr檢測體系和數(shù)字pcr檢測體系，然后可分別用于人ctnnb1基因19種突變的熒光定量pcr檢測或人ctnnb1基因19種突變的數(shù)字pcr檢測。

16、在一些實施例中，上述檢測試劑盒中還包括擴增試劑，其中包括緩沖液、dntps、taqdna聚合酶和mgcl2等用于擴增的反應(yīng)試劑。

17、在一些實施例中，熒光定量pcr檢測體系和數(shù)字pcr檢測體系中正向引物的工作濃度為0.15μm-0.2μm、lna阻滯探針的工作濃度為0.25μm-0.45μm；正向引物和lna阻滯探針的摩爾濃度比為：3-4：5-9。

18、當進行熒光定量pcr檢測時，其檢測體系中包括：正向引物、反向引物、taqman探針、lna阻滯探針、正向內(nèi)參引物、反向內(nèi)參引物、內(nèi)參探針、擴增試劑、樣本和超純水。

19、可選地，當熒光定量pcr的檢測體系為20μl時，其檢測體系中包括：3μm正向引物、4μm反向引物、4μm?taqman探針、5μm?lna阻滯探針、3μm正向內(nèi)參引物、4μm反向內(nèi)參引物、4μm內(nèi)參探針、10μl擴增試劑、1～3μl樣本，超純水補至20μl。

20、可選地，熒光定量pcr的反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s,58～70℃延伸30s，共40個循環(huán)。其中，退火溫度優(yōu)選為66℃，但在58～70℃下都可以區(qū)分突變型模板和野生型模板，12℃的溫度范圍大大降低了檢測對儀器精密性的要求。

21、當進行數(shù)字pcr檢測時，其檢測體系中包括：正向引物、反向引物、taqman探針、lna阻滯探針、正向內(nèi)參引物、反向內(nèi)參引物、內(nèi)參探針、擴增試劑、樣本和超純水。

22、可選地，當數(shù)字pcr的檢測體系為16μl時，其檢測體系中包括：3μm正向引物、4μm反向引物、4μm?taqman探針、5μm?lna阻滯探針、3μm正向內(nèi)參引物、4μm反向內(nèi)參引物、4μm內(nèi)參探針、8μl?2×擴增試劑、1～3μl樣本，超純水補至16μl。

23、可選地，數(shù)字pcr的反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s,63℃延伸30s，共40個循環(huán)。

24、本發(fā)明熒光定量體系檢測限低至0.1％，有些突變位點甚至達到0.01％，根據(jù)ct值與vaf的線性關(guān)系定量vaf，再結(jié)合sanger測序確定突變類型。數(shù)字pcr體系可對低至0.01％的突變進行檢測并準確定量vaf，實現(xiàn)對ctdna的有效檢測。

25、本發(fā)明提供的試劑盒的檢測樣本不僅限于血液，還能用于福爾馬林固定石蠟包埋組織(formalin-fixed,paraffin-embedded?tissue，ffpe)、腦脊液(cerebrospinalfluid，csf)、胸腹水(pleural?and?peritoneal?fluid，pf)等多種樣本的精準檢測。

26、本發(fā)明具有以下有益效果：

27、(1)靶標覆蓋全面，通量高

28、本發(fā)明利用一條長lna修飾阻滯探針全面覆蓋靶標區(qū)域，可在一管內(nèi)同時實現(xiàn)對19種突變類型的檢測，同時通過多重熒光通道對內(nèi)參基因進行檢測，從而實現(xiàn)對反應(yīng)過程的質(zhì)控以及定量。同時，sanger測序受制于低靈敏度，但lna修飾阻滯探針對突變基因的富集可以實現(xiàn)對突變基因的高靈敏度檢測。

29、(2)靈敏度高，精確定量

30、利用本發(fā)明的lna阻滯探針對突變模板進行富集，阻滯野生型模板擴增，相較于野生型模板，對突變型模板的富集倍數(shù)達1000～65000倍，從而實現(xiàn)對突變分子的高靈敏度檢測。本發(fā)明所建立的qpcr體系檢測限低至0.01％～0.1％，且技術(shù)的擴展性強，通過與sanger測序結(jié)合，可實現(xiàn)對突變分子的有效定量；所建立的數(shù)字pcr體系檢測限低至0.01％，并可精確定量出基因的突變頻率。

31、(3)適用于多種類型樣本的檢測

32、本發(fā)明的檢測試劑盒以及檢測方法能夠適用于包括腫瘤組織、腦脊液、血液和胸腹水在內(nèi)的多種樣本的精準檢測，液體活檢可打破傳統(tǒng)的組織活檢的局限性，加上數(shù)字pcr的高靈敏度、精確度特點，對腫瘤的早篩起到了重要的作用。

33、(4)應(yīng)用場景更廣且臨床價值高

34、本發(fā)明的熒光定量pcr檢測體系可以在58～70℃的退火溫度范圍內(nèi)進行有效檢測，大大降低了對儀器精密性的要求；且經(jīng)過lna阻滯探針富集之后提高了sanger測序的靈敏度，只需0.1ng的樣本量就可對低至1.86％vaf的石蠟切片樣本進行檢測確定突變類型，適合在醫(yī)院開展檢測。