本發(fā)明涉及生物傳感器，特別是一種用于檢測hsp70的磁性納米電化學(xué)適配體傳感器，屬于生物工程技術(shù)創(chuàng)新。

背景技術(shù)：

1、核酸適配體是一小段經(jīng)體外篩選得到的寡核苷酸序列或者短鏈多肽，適配體能夠與對應(yīng)的配體進(jìn)行高親和力和強(qiáng)特異性的結(jié)合，可用于腫瘤標(biāo)志物的診斷、癌癥細(xì)胞靶向治療。通過適配體高特異性地識別和結(jié)合腫瘤相關(guān)的生物標(biāo)志物，可以在腫瘤早期發(fā)現(xiàn)特定腫瘤標(biāo)志物，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷，特別是可以識別血液中的腫瘤標(biāo)志物，具有極高的特異性優(yōu)勢。此外，核酸適配體還可以與成像試劑結(jié)合，用于體內(nèi)外的分子成像研究，觀察特定生物分子在體內(nèi)的分布和動(dòng)態(tài)變化，監(jiān)測疾病的發(fā)展或治療效果。最后，核酸適配體還可以抗腫瘤藥物結(jié)合形成藥物偶聯(lián)物，利用核酸適配體特異性地識別癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)癌癥靶向治療。

2、肝細(xì)胞癌（hepatocellular?carcinoma，hcc）是最常見的肝癌類型之一，它起源于肝臟的肝細(xì)胞。肝細(xì)胞癌通常是在肝硬化（肝臟組織廣泛纖維化和硬化）的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，肝硬化是肝臟長期損傷和修復(fù)的結(jié)果。

3、電化學(xué)適配體由于選擇的適配體序列通常是通過selex技術(shù)（指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)），從隨機(jī)單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸配體（aptamer）。適配體的篩選過程涉及人工化學(xué)合成一個(gè)包含隨機(jī)寡核苷酸序列的文庫，其總長度一般為70?~?100個(gè)核苷酸，中間包含20?~?40個(gè)核苷酸的隨機(jī)序列。通過多輪篩選，最終獲得對特定靶標(biāo)具有高親和力和高特異性的寡核苷酸序列，即適配體。

4、現(xiàn)有技術(shù)設(shè)計(jì)篩選的適配體，只能實(shí)現(xiàn)與靶物質(zhì)特異性高度親和作用，但是無法進(jìn)行篩選靶向物質(zhì)，特別是不能夠進(jìn)行靶向物質(zhì)定向轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致核酸適配體在電化學(xué)分析研究中應(yīng)用受到較大的限制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的核酸適配體雖然具有靶物質(zhì)高度親和力，但不具有定向轉(zhuǎn)移篩選的問題，本發(fā)明提供一種用于檢測hsp70的磁性納米電化學(xué)適配體及傳感器。

2、本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的第一方面，提供一種核酸適配體：

4、一種用于檢測hsp70的磁性納米電化學(xué)適配體，所述適配體的核酸序列為seqno.1。

5、本發(fā)明的第二方面，提供一種核酸適配體傳感器：

6、用于檢測hsp70的磁性納米電化學(xué)適配體傳感器，所述適配體傳感器是包括金包裹磁性fe3o4的納米顆粒，以及在所述納米顆粒表面的適配體；

7、所述適配體的核酸序列為seq?no.1；

8、核酸適配體序列seq?no.1為：ccaacaacccaacttgattcaccgaacactcgcgtgg。該核酸適配體序列是hsp70適配體apt7的序列。

9、進(jìn)一步，所述適配體通過巰基固定在納米顆粒表面。其中，納米顆粒是fe3o4@au納米顆粒，即金包裹的磁性fe3o4納米顆粒。

10、即，fe3o4@au納米顆粒是通過金包裹磁性fe3o4的納米顆粒而成。

11、本發(fā)明的hsp70的磁性納米電化學(xué)適配體具有磁性納米金顆粒的連接部分，可以在外部磁場的作用下實(shí)現(xiàn)核酸適配體的定向移動(dòng)。通過適配體上的殘基與熱休克蛋白70（hsp70）之間的相互作用，可以實(shí)現(xiàn)hsp70的檢測診斷。hsp70是細(xì)胞在應(yīng)激條件下被誘導(dǎo)表達(dá)的應(yīng)急蛋白，hsp70家族成員控制著細(xì)胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的所有方面，腫瘤細(xì)胞中hsp70s表達(dá)上調(diào)，與腫瘤治療過程中耐藥性的形成具有密切關(guān)系。通過本發(fā)明的適配體連接fe3o4@au納米顆粒可以高選擇性的對hsp70進(jìn)行篩選，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對于腫瘤的診斷分析，以及作為靶向抑制hsp70功能的潛力，對于治療耐藥型惡性腫瘤具有重要意義。

12、純化的hsp70（從mybiosource公司購買），純化的單鏈寡核苷酸原始文庫，該文庫由40個(gè)核苷酸（5′-?atccagagtgacgcagca-n40-tggacacggtggcttagt-3′）組成，兩側(cè)是5′和3′末端的18個(gè)核苷酸引物結(jié)合位點(diǎn)，以及正向引物（5′-?atccagagtgacgcagca-3′）和5'磷酸化修飾的反向引物（5′-?actaagccaccgtgtcca-3′）由sigma-aldrich（印度）合成。其中，磁性納米金顆粒也稱磁性金納米顆粒，不同于常規(guī)的金納米顆粒au-nps，本發(fā)明的磁性金納米顆粒是通過在磁性四氧化三鐵表面包裹金層形成的具有磁性的金納米顆粒，故能夠通過磁性引導(dǎo)，輔助主動(dòng)磁場控制，有利于檢測分析。

13、本發(fā)明的第三方面，提供一種核酸適配體傳感器制備方法：

14、進(jìn)一步，本發(fā)明還提供上述用于檢測hsp70的磁性納米電化學(xué)適配體傳感器的制備方法，包括以下步驟：

15、s1、篩選hsp70適配體：通過selex技術(shù)篩選得到具有hsp70親和力的適配體，所述適配體包含核酸序列seq?no.1的序列。

16、s2、制備fe3o4@au納米顆粒：將0.1?~?0.5?wt%濃度氯金酸溶液，優(yōu)選0.2wt%的haucl4溶液，在攪拌下加熱至沸騰；加入fe3o4?納米顆粒，繼續(xù)加熱攪拌5?~?20分鐘，逐滴加入0.2?~?2?wt%的檸檬酸三鈉溶液，優(yōu)選1wt%的檸檬酸三鈉溶液；檸檬酸三鈉溶液的用量為原始料液體積的5%~10%；加入檸檬酸三鈉溶液反應(yīng)后，溶液的顏色由棕色變?yōu)榇u紅色；

17、當(dāng)顏色停止變化時(shí)，移除熱源；待溶液冷卻至室溫后，用磁鐵分離沉淀并離心；

18、將分離得到的納米材料，真空干燥并重新分散，得到fe3o4@au納米顆粒，備用；

19、s3、連接：將s1篩選得到的hsp70核酸適配體5’端，用巰基(-sh)修飾；

20、然后，加入fe3o4@au納米顆粒，核酸適配體5’端修飾巰基在fe3o4@au納米顆粒表面固定，得到適配體修飾后的fe3o4@au納米顆粒，即為用于檢測hsp70的磁性納米電化學(xué)適配體傳感器。

21、本發(fā)明方法對于電化學(xué)適配體傳感器采用磁性納米金顆粒進(jìn)行連接，利用巰基實(shí)現(xiàn)適配體和磁性核心的有效連接，當(dāng)適配體和hsp70形成特異性結(jié)合以后，通過fe3o4@au納米顆?？梢园l(fā)揮定向引導(dǎo)的作用，也可以利用磁力將適配體修飾后的fe3o4@aunps固定在工作電極表面，通過逐步增加納米材料的體積來優(yōu)化濃度并采用mch封閉未結(jié)合位點(diǎn)。配合帶有磁力的玻碳電極作為工作電極，可以實(shí)現(xiàn)快速高效的檢測分析作用。

22、進(jìn)一步，還包括：將適配體修飾后的fe3o4@au納米顆粒固定在檢測試紙條或傳感器上。

23、優(yōu)選的，固定完成后，用蒸餾水沖洗傳感器表面以除去任何未固定的分子，然后在4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

24、本發(fā)明方案相比于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下優(yōu)勢：

25、采用磁性納米顆粒連接的hsp70適配體制成的傳感器，對于hsp70具有極高的靈敏度，只需要極低的hsp70含量即可完成準(zhǔn)確的檢測結(jié)果分析。

26、對于hsp70蛋白形成特異性反應(yīng)以后，通過外界磁場引導(dǎo)，可以在傳感器上快速讀取得到相應(yīng)的檢測信號。