本發(fā)明涉及植物基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，特別是涉及一種甜瓜葉形控制基因cmsl及其編碼蛋白與應(yīng)用。與該基因或編碼蛋白相關(guān)的生物材料可用于創(chuàng)制葉形變異的甜瓜材料。

背景技術(shù)：

1、甜瓜(cucumis?melo?l.)是一種重要的園藝經(jīng)濟(jì)作物。葉片是甜瓜的重要功能器官，不同的甜瓜品種其葉片形狀多種多樣，常見(jiàn)的有圓形、心形、腎形以及葉緣缺刻深淺不同而形成的裂葉類(lèi)型。葉片形態(tài)是甜瓜株型的重要構(gòu)成因素，不同葉片大小、形狀直接影響甜瓜的種植密度，影響甜瓜的品質(zhì)和產(chǎn)量。克隆甜瓜的葉形控制基因?qū)τ谂嘤硐胫晷吞鸸?，進(jìn)而提高甜瓜的品質(zhì)和產(chǎn)量具有重要意義。

2、國(guó)外從20世紀(jì)90年代開(kāi)始開(kāi)展葉片發(fā)育的機(jī)制研究，在擬南芥、番茄和水稻等模式植物中揭示了大量與葉片形態(tài)建成相關(guān)的基因。在葫蘆科作物中，wei等人利用商品西瓜雜交種構(gòu)建裂葉和非裂葉分離群體進(jìn)行遺傳分析，并定位了一個(gè)西瓜裂葉基因clll1，推測(cè)一個(gè)未知功能蛋白和一個(gè)同源框-亮氨酸拉鏈蛋白是最可能的候選基因(wei?et?al.,2017)。jiang等利用基因編輯技術(shù)敲除了gras家族的lateral?suppressor的同源基因clls獲得了圓葉西瓜突變體(jiang?et?al.,2023)。zhang等從黃瓜自交系ccmc的ems突變體庫(kù)中，鑒定了兩份圓葉等位突變體c356和c949，基因定位表明一個(gè)編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的cspid基因?yàn)槟康幕?zhang?etal.,2018)。gao等以掌狀裂葉自然突變體bm7為材料對(duì)甜瓜掌狀裂葉基因pll進(jìn)行了精細(xì)定位，推測(cè)一個(gè)注釋為ant轉(zhuǎn)錄因子的基因?yàn)樽罴押蜻x基因(gao?et?al.,2014)?；谝陨戏治觯鸸现猩袩o(wú)葉形相關(guān)基因功能研究的報(bào)道，制約了葉形相關(guān)基因在甜瓜中的應(yīng)用。

3、yabby家族是一類(lèi)植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族,其成員在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和形態(tài)發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。yabby基因家族歸屬于鋅指蛋白超家族的亞家族，家族包c(diǎn)2h2鋅指蛋白與yabby結(jié)構(gòu)域，分別位于c鏈n端與c端，兩者之間具有極強(qiáng)的保守性。在西紅柿、擬南芥等植物中，yabby基因家族包含5個(gè)亞族，分別為crc、fil/yab3、ino、yab2與yab5。其中，fil、yab2和yab3在地上側(cè)生器官原基中表達(dá)，特異性地決定側(cè)生器官遠(yuǎn)軸端細(xì)胞的命運(yùn)，fil、yab2、yab3和yab5在擬南芥葉發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出功能冗余，主要在營(yíng)養(yǎng)組織中特異表達(dá)；而crc和ino在花器官中特異表達(dá)，crc基因主要調(diào)控?cái)M南芥的心皮和蜜腺的發(fā)育，ino基因在擬南芥胚珠發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的功能。而甜瓜中yabby家族基因功能并未完全闡明，急需對(duì)相關(guān)基因開(kāi)展相關(guān)功能鑒定，以更好的在育種中利用這些基因。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明目的在于提供一種甜瓜葉形控制基因cmsl及其編碼蛋白與應(yīng)用。本發(fā)明具體實(shí)例中利用crispr/cas9基因組編輯系統(tǒng)對(duì)甜瓜材料基因組中的基因cmsl進(jìn)行編輯，進(jìn)而使所述cmsl基因功能喪失，得到葉形變異的甜瓜材料。從而證明基因cmsl發(fā)生突變后可產(chǎn)生葉形變異的甜瓜新品種。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明第一方面提供了控制甜瓜葉形的蛋白質(zhì)cmsl，具有如下(1)至(3)任一項(xiàng)所述的氨基酸序列：

4、(1)如序列表中序列4所示氨基酸序列；

5、(2)序列表中序列4所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的添加、取代或缺失而衍生的氨基酸序列，且衍生的氨基酸序列具有調(diào)控甜瓜葉形的功能；

6、(3)來(lái)源于甜瓜、與(1)或(2)的氨基酸序列至少具有90％以上(比如91％、93％、95％、97％、98％或99％)同源性且具有控制甜瓜葉形的功能的氨基酸序列；

7、所述控制甜瓜葉形包括控制甜瓜的葉緣無(wú)缺刻。也就是說(shuō)，蛋白質(zhì)cmsl調(diào)控甜瓜葉形比如調(diào)控甜瓜的葉緣形狀，當(dāng)甜瓜中含有蛋白質(zhì)cmsl時(shí)，甜瓜的葉緣無(wú)缺刻，該蛋白質(zhì)由245個(gè)氨基酸殘基組成。

8、所述葉緣無(wú)缺刻是指成熟葉片的葉緣沒(méi)有深淺不一的凹凸形態(tài)，比如葉緣為全緣和/或有均勻的細(xì)鋸齒，鋸齒深度優(yōu)選不超過(guò)0.5cm。

9、進(jìn)一步地，所述控制甜瓜葉形還可以包括控制成熟甜瓜葉片的長(zhǎng)寬比，葉片的長(zhǎng)寬比(長(zhǎng)度最大值與寬度最大值的比)優(yōu)選為0.79～0.83或者表示為(0.81±0.02)。

10、本發(fā)明第二方面提供了甜瓜葉形控制基因cmsl，其cdna的核苷酸序列為如下(a1)至(a3)中的任意一種：

11、(a1)編碼本發(fā)明第一方面的所述氨基酸序列的dna序列；

12、(a2)如序列表中序列3所示的dna序列；

13、(a3)在嚴(yán)格條件下與(a1)所述的dna序列雜交且編碼控制甜瓜葉形功能的蛋白質(zhì)分子的dna序列；

14、所述控制甜瓜葉形包括控制甜瓜的葉形為葉緣無(wú)缺刻。

15、所述的葉緣無(wú)缺刻是指成熟葉片的葉緣沒(méi)有深淺不一的凹凸形態(tài)，比如葉緣為全緣和/或僅有均勻的細(xì)鋸齒，鋸齒深度優(yōu)選不超過(guò)0.5cm。

16、進(jìn)一步地，所述控制甜瓜葉形還可以包括控制成熟甜瓜葉片的長(zhǎng)寬比，葉片的長(zhǎng)寬比優(yōu)選為0.79～0.83或者表示為(0.81±0.02)。

17、本發(fā)明第三方面提供與本發(fā)明第一方面所述的蛋白質(zhì)或與本發(fā)明第二方面所述的基因相關(guān)的生物材料，所述生物材料選自如下(a)或(b)：

18、(a)用于沉默、抑制或敲除本發(fā)明第一方面所述蛋白質(zhì)cmsl的編碼基因或本發(fā)明第二方面所述基因的物質(zhì)；

19、(b)用于降低或抑制甜瓜中本發(fā)明第一方面所述蛋白質(zhì)cmsl的活性和/或含量的物質(zhì)。

20、本發(fā)明第三方面的生物材料可以是實(shí)現(xiàn)(a)或(b)所述功能的任意材料，從效率和操作上來(lái)考慮，所述生物材料優(yōu)選為甜瓜crispr/cas9基因組編輯系統(tǒng)，包括：重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包括cas9表達(dá)盒、sgrna表達(dá)盒，所述cas9表達(dá)盒表達(dá)cas9，sgrna表達(dá)盒表達(dá)sgrna，所述sgrna的靶標(biāo)基因?yàn)樘鸸现械鞍踪|(zhì)cmsl的編碼基因；

21、進(jìn)一步地，所述sgrna的靶標(biāo)序列為序列表中序列5所示的dna分子，或者所述sgrna的靶標(biāo)序列為序列表中序列5所示序列的反向互補(bǔ)序列。

22、所述生物材料還可以是含有上述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、含有上述重組表達(dá)載體的宿主菌等可用于基因編輯的產(chǎn)品。另外，從基因編輯系統(tǒng)轉(zhuǎn)化后得到的甜瓜材料中篩選出發(fā)生預(yù)期基因突變材料所使用的用于擴(kuò)增cmsl基因中任一片段的引物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

23、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，含有上述重組表達(dá)載體的宿主菌為含有重組表達(dá)載體pbse401::cmsl的農(nóng)桿菌eha105。

24、本發(fā)明第四方面提供了本發(fā)明第三方面所述生物材料在創(chuàng)制葉形變異的甜瓜材料或甜瓜育種中的應(yīng)用，所述葉形變異的甜瓜材料為葉緣有缺刻的葉形變異的甜瓜材料。

25、本發(fā)明中所述的葉緣有缺刻是指葉緣存在深淺不一的凹凸形態(tài)，缺刻明顯。

26、本發(fā)明第五方面提供了一種改變甜瓜葉形的方法，所述方法包括：利用本發(fā)明第三方面所述生物材料使所述cmsl功能喪失，從而得到葉形變異的甜瓜材料。

27、優(yōu)選地，所述方法包括，利用上述甜瓜crispr/cas9基因組編輯系統(tǒng)對(duì)待改變?nèi)~形的甜瓜材料基因組中的基因cmsl進(jìn)行編輯，進(jìn)而使所述cmsl功能喪失，得到葉形變異的甜瓜材料。

28、進(jìn)一步地，所述葉形改變的甜瓜材料為葉緣有缺刻的甜瓜材料。

29、在本發(fā)明第五方面的方法中，作為一種優(yōu)選方式，所述方法具體包括：

30、s1：向所述待改變?nèi)~形的甜瓜材料中導(dǎo)入上述甜瓜crispr/cas9基因組編輯系統(tǒng)，通過(guò)篩選得到轉(zhuǎn)化成功的植株；

31、s2：通過(guò)鑒定從所述轉(zhuǎn)化成功的植株中獲得基因cmsl突變株系；

32、所述鑒定為以轉(zhuǎn)化成功的植株的基因組作為模板進(jìn)行基因cmsl片段的pcr擴(kuò)增，然后通過(guò)凝膠電泳或者測(cè)序的方法檢測(cè)以得到基因cmsl突變的株系。

33、進(jìn)一步地，所述pcr擴(kuò)增采用的引物對(duì)如序列表中序列10和序列11。

34、在本發(fā)明第五方面中，所述待改變?nèi)~形的甜瓜材料是基因組中含有基因cmsl的甜瓜材料，比如甜瓜材料m6。

35、借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有如下明顯的有益效果：

36、(1)本發(fā)明提供了一個(gè)甜瓜基因(開(kāi)放閱讀框核苷酸序列如序列3中第136位至第873位核苷酸序列所示)及其編碼的蛋白(氨基酸序列如序列4所示)。經(jīng)過(guò)基因編輯技術(shù)確定該基因可以控制或調(diào)控甜瓜葉形，比如調(diào)控甜瓜葉緣和/或葉片長(zhǎng)寬比，在控制葉緣的形狀方面，該基因的突變將導(dǎo)致全緣葉形或葉緣為均勻細(xì)鋸齒狀的無(wú)缺刻葉形變?yōu)槿~緣有明顯缺刻的葉形。在葉片長(zhǎng)寬比方面，該基因的突變將導(dǎo)致葉片長(zhǎng)寬比顯著變小。

37、(2)利用基因編輯技術(shù)，通過(guò)對(duì)甜瓜中cmsl基因進(jìn)行編輯，可導(dǎo)致甜瓜葉形的改變。因而該基因有控制葉形的作用?；谠摶虻淖饔?，可以直接通過(guò)基因編輯技術(shù)使相應(yīng)甜瓜品種中的基因cmsl發(fā)生突變，然后通過(guò)與純合的基因cmsl突變植株進(jìn)行常規(guī)雜交，并通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇獲得葉形變異甜瓜的優(yōu)良品種；或者通過(guò)基因工程將該基因cmsl轉(zhuǎn)入特定甜瓜內(nèi)，進(jìn)而對(duì)該基因進(jìn)行編輯，造成該基因突變來(lái)獲得葉形改變的甜瓜材料，然后利用基因突變后的材料進(jìn)行有性雜交從后代群體中分離出葉形改變的甜瓜材料。，利用cmsl基因可對(duì)甜瓜的葉形進(jìn)行改良，具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

38、總之，本發(fā)明的基因編輯方法可以快速、有效地將甜瓜葉緣無(wú)缺刻的葉形材料轉(zhuǎn)變?yōu)槿~緣有缺刻的葉形變異的甜瓜材料，為創(chuàng)制葉形多樣的甜瓜材料提供了一條經(jīng)濟(jì)、快速、有效的途徑，在甜瓜新品種培育中具有重要的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)前景。