本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種非洲豬瘟三重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

1、非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒(african?swine?fever?virus，asfv)引起的急性、烈性、高度接觸性的傳染病，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的威脅。2020年，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家非洲豬瘟專業(yè)實(shí)驗(yàn)室在開(kāi)展非洲豬瘟流行病學(xué)監(jiān)測(cè)及病原學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，我國(guó)部分省區(qū)出現(xiàn)了低致死率的非洲豬瘟2型自然變異流行株，如mgf基因缺失株，這些基因缺失株與典型強(qiáng)毒株相比，其致病力降低，但仍具有明顯的殘留毒力，較高劑量接種豬可引起亞急性、慢性病程和部分死亡，較低劑量感染則主要引起持續(xù)感染和慢性病程，具有很強(qiáng)的水平傳播能力。2022年6月3日，越南中央動(dòng)物藥業(yè)股份公司生產(chǎn)的非洲豬瘟疫苗(asfv-g-δi177l)正式獲得越南農(nóng)業(yè)和農(nóng)村發(fā)展部批準(zhǔn)在越南上市，該疫苗存在嚴(yán)重的排毒現(xiàn)象，對(duì)育肥豬有殘留毒性，對(duì)此，我們?cè)趪?yán)防越南疫苗毒傳入的同時(shí)也要制定和采取應(yīng)對(duì)策略，加強(qiáng)對(duì)疫苗毒的檢測(cè)。

2、目前商品化的試劑盒大部分為p72單一基因的pcr擴(kuò)增，并不能同時(shí)滿足于p72、i177l和mgf三種基因的鑒別診斷，無(wú)法快速而又準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)非洲豬瘟疫情的發(fā)生。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種非洲豬瘟三重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明提供的試劑盒針對(duì)非洲豬瘟病毒的p72基因、豬β-actin基因、i177l基因和mgf基因分別設(shè)計(jì)了熒光pcr引物和探針，建立了熒光pcr檢測(cè)方法，可以快速鑒別非洲豬瘟病毒野毒株和基因缺失株，本發(fā)明的pcr引物探針組包括seq?id?no.1所示的p72-f、seq?id?no.2所示的p72-r、seq?id?no.3所示的p72-探針，seq?id?no.4所示的內(nèi)參-f、seq?id?no.5所示的內(nèi)參-r、seq?id?no.6所示的內(nèi)參-探針，seq?id?no.7所示的i177l-f、seq?id?no.8所示的i177l-r、seq?id?no.9所示的i177l-探針，seq?id?no.10所示的mgf-f、seq?id?no.11所示的mgf-r、seq?id?no.12所示的mgf-探針。將該引物探針組制備成試劑盒，可特異的同時(shí)檢測(cè)非洲豬瘟p72基因、i177l基因和mgf基因，靈敏度可達(dá)到5拷貝/μl。本試劑盒的最低檢測(cè)線可達(dá)5拷貝/μl，試劑盒提供的內(nèi)參避免了假陰性的出現(xiàn)，提供的dutp/ung防污染系統(tǒng)避免了氣溶膠污染、防止非特異性擴(kuò)增，提供的抗pcr抑制物因子確保了擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，本發(fā)明在避免假陽(yáng)性、假陰性、防止非特異性的基礎(chǔ)上，建立了一種新的靈敏度更高、特異性更強(qiáng)、穩(wěn)定性更優(yōu)的鑒別非洲豬瘟野毒株及多種變異株的熒光定量pcr方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、一種非洲豬瘟三重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)試劑盒，包括asfv?p72基因特異引物探針、內(nèi)參豬β-actin的引物探針、asfv?i177l基因特異引物探針和asfv?mgf基因特異引物探針。

4、(1)針對(duì)p72基因的如下引物探針：

5、p72基因正向引物：5’-tacacgttcgctgcgtatca-3’(seq?id?no.1)

6、p72基因反向引物：5’-tatcggtggagggaaccagt-3’(seq?id?no.2)

7、p72基因探針：5’-fam-catcggtaagaataggtttgc-bhq1-3’(seq?id?no.3)

8、所述p72引物探針的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)fluorophore為fam，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)quencher為bhq1。所述p72引物能靈敏且特異的檢測(cè)非洲豬瘟病毒感染；

9、(2)針對(duì)內(nèi)參豬β-actin基因的如下引物探針：

10、內(nèi)參基因正向引物：5’-agagcaagagaggcatcctg-3’(seq?id?no.4)

11、內(nèi)參基因反向引物：5’-cacgcagctcgttgtagaag-3’(seq?id?no.5)

12、內(nèi)參基因探針：5’-hex-catcgagcacggcatcgtcac-bhq1-3’(seq?idno.6)

13、所述內(nèi)參引物探針的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)fluorophore為hex，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)quencher為bhq1。所述內(nèi)參引物能準(zhǔn)確監(jiān)控反應(yīng)體系的穩(wěn)定性；

14、(3)針對(duì)i177l基因的如下引物探針：

15、i177l基因正向引物：5’-atcctagcttgccggtaatgg-3’(seq?id?no.7)

16、i177l基因反向引物：5’-tgccaagcttcagccactaa-3’(seq?id?no.8)

17、i177l基因探針：5’-rox-ttggtaccagtaacactaat-bhq2-3’(seq?id?no.9)

18、所述i177l引物探針的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)fluorophore為rox，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)quencher為bhq2。i177l引物能靈敏且特異的檢測(cè)非洲豬瘟病毒感染；

19、(4)針對(duì)mgf基因的如下引物探針：

20、mgf基因正向引物：5’-gatgtcacggctcccttcaa-3’(seq?id?no.10)

21、mgf基因反向引物：5’-ttgtttccttcctctcccgc-3’(seq?id?no.11)

22、mgf基因探針：5’-cy5-taggagacgaccacatactc-bhq3-3’(seq?id?no.12)

23、所述mgf引物探針的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)fluorophore為cy5，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)quencher為bhq3。所述mgf引物能靈敏且特異的檢測(cè)非洲豬瘟病毒感染。

24、作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案，所述試劑盒的熒光pcr反應(yīng)體系為2×ex?tag?mix?forqpcr?12.5μl，10μmol/l?p72-f/p72-r各0.5μl，10μmol/l內(nèi)參-f/內(nèi)參-r各0.5μl，10μmol/li177l-f/i177l-r各0.5μl，10μmol/lmgf-f/mgf-r各0.5μl，加入3.5μl滅菌水使pcr體系為20μl，模板dna的體積為5μl，總體系為25μl。pcr反應(yīng)體系中p72基因引物的濃度為0.4～0.8μm，p72基因探針的濃度為0.08～0.8μm；所述pcr反應(yīng)體系中內(nèi)參基因引物的濃度為0.4～0.8μm，內(nèi)參基因探針的濃度為0.08～0.8μm；所述pcr反應(yīng)體系中i177l基因引物的濃度為0.4～0.8μm，i177l基因探針的濃度為0.08～0.8μm；所述pcr反應(yīng)體系中mgf基因引物的濃度為0.4～0.8μm，mgf基因探針的濃度為0.08～0.8μm。

25、作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案，所述試劑盒的pcr反應(yīng)條件為：50℃2min，95℃預(yù)變性5min，95℃15s，60℃30s，此步采集熒光，同時(shí)采集fam、hex、rox和cy5四個(gè)通道的熒光值，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

26、本發(fā)明還提供了引物探針組在制備用于鑒別非洲豬瘟野毒株和基因缺失毒株的試劑盒中的應(yīng)用；以及引物探針組在制備用于鑒別非洲豬瘟全病毒感染與非洲豬瘟基因缺失株的試劑盒中的應(yīng)用。

27、本發(fā)明具有以下有益效果：

28、1、本發(fā)明可以在asfv鑒別診斷野毒感染或基因缺失毒株感染，當(dāng)豬感染野毒時(shí)，p72基因、內(nèi)參基因、i177l基因和mgf基因均有擴(kuò)增曲線；而當(dāng)豬為基因缺失毒感染時(shí)，p72基因、內(nèi)參基因有擴(kuò)增曲線，i177l基因或(和)mgf基因無(wú)擴(kuò)增曲線。本發(fā)明采用熒光定量pcr方法，不但可以快速、簡(jiǎn)便的對(duì)豬體的感染情況進(jìn)行確診，還可以對(duì)病原進(jìn)行定量分析。本發(fā)明設(shè)計(jì)的p72基因引物、i177l基因引物和mgf基因引物的最低檢測(cè)限為5個(gè)拷貝數(shù)，且本發(fā)明設(shè)計(jì)的內(nèi)參引物的應(yīng)用可避免假陽(yáng)性的產(chǎn)生，同時(shí)引入了dutp/ung防污染系統(tǒng)，可完全消除來(lái)自擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠污染，反應(yīng)液中添加抗pcr抑制物因子，使本發(fā)明所提供的方法更適用于復(fù)雜的動(dòng)物臨床樣本的檢測(cè)。

29、2、本發(fā)明的非洲豬瘟病毒p72基因、i177l基因和mgf基因的熒光定量pcr檢測(cè)方法與豬偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬口蹄疫病毒、豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒均無(wú)交叉反應(yīng)，結(jié)果表明，本發(fā)明具有較強(qiáng)的特異性。

30、為更清楚地闡述本發(fā)明的結(jié)構(gòu)特征和功效，下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。