本發(fā)明涉及一種洋蔥來源外泌體的提取純化方法以及在皮膚抗炎中的應(yīng)用，屬于生物。

背景技術(shù)：

1、早在20世紀(jì)六十年代，植物中有細(xì)胞外囊泡（ev）的研究就已被報(bào)道外泌體是一種能被機(jī)體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞分泌的具有脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)的微小囊泡。外泌體的大?。?0nm~?150?nm，大多數(shù)類型的細(xì)胞都可以分泌外泌體。外泌體在自然界中也廣泛存在，包括哺乳動(dòng)物的血液、眼淚、尿液、唾液、乳汁等，植物的根莖葉中，外泌體中富含核酸、蛋白、脂質(zhì)等活性生物分子。外泌體頻繁穿梭于細(xì)胞之間，為細(xì)胞之間的通信提供了橋梁，成為疾病標(biāo)志物、疾病機(jī)理、藥物開發(fā)等研究的創(chuàng)新熱點(diǎn)。外泌體在免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復(fù)等生理病理上起著重要的作用。

2、自然界中植物廣泛存在，中國是世界上最大的洋蔥生產(chǎn)國，每年的產(chǎn)量約為2400萬噸，占全球洋蔥產(chǎn)量的23%左右。中國的洋蔥種植面積廣闊，各地區(qū)均有生產(chǎn)，主要集中在山東、甘肅、河北、江蘇、四川等省份。洋蔥外泌體具有抗炎、抗氧化和修復(fù)的功效，可對皮膚的護(hù)理起到較好的功效作用。

3、目前對于動(dòng)物來源的外泌體的提取方法有很多，也比較成熟，但對于洋蔥來源的外泌體的提取方法卻比較欠缺，暫無相關(guān)的可以大批量提取的方法，由于洋蔥細(xì)胞的特殊性，具有較厚的細(xì)胞壁、富含纖維成分并且果實(shí)中含有較多的果膠成分，比較堅(jiān)硬和粘稠，難以提取純化外泌體，尚無特別高效的方法進(jìn)行大批量的提取純化處理。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的洋蔥來源外泌體的提取純化方法以及在皮膚抗炎中的應(yīng)用能夠通過對洋蔥進(jìn)行酶解，在進(jìn)行離心過濾，得到澄清的上清液，在進(jìn)行超濾換液處理，得到比較純凈的外泌體粗品，最后經(jīng)過離子交換層析的方法得到最終的外泌體的產(chǎn)品，并進(jìn)行功效的研究，對于抗炎具有比較明顯的作用。

2、其中，利用纖維素酶和果膠酶堿進(jìn)行處理洋蔥的碎塊，從而得到比較充分的洋蔥的懸濁液，更利于外泌體的釋放。利用超濾換液的方法可以去除洋蔥外泌體中的一些小分子的雜質(zhì)，從而得到粗提取的洋蔥外泌體的產(chǎn)物。利用離子交換層析的方法進(jìn)行外泌體粗提取物的進(jìn)一步純化，留取流穿液，即為外泌體最終產(chǎn)物，得到較純外泌體，皮膚抗炎效果較為明顯。

3、現(xiàn)有的離心法對于設(shè)備的要求比較高，需要比較先進(jìn)的大型離心機(jī)，能夠達(dá)到較高的離心力，但成本投入較高，難以廣泛的應(yīng)用。peg沉淀法對于試劑的殘留的去除較難，容易導(dǎo)致產(chǎn)品里的殘留而難以去除，且沉淀的效果較差，不能完全的得到外泌體，損失較大。而密度梯度離心的方法，處理的外泌體的量較小，只能處理小批量的外泌體，用于科研研究用，并不能進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)。凝膠過濾層析的上樣量比較受限，同樣的層析柱體積處理樣品體積較小，柱子要求體積較大，容易吸附雜質(zhì)而導(dǎo)致難以清潔，成本較高，不適合大批量的制備。因此，需要一種既能夠大批量的高純度的提取純化外泌體，又能夠比較節(jié)約成本的方法。

4、通過對大量的洋蔥的前處理，破碎、酶解，得到洋蔥的碎渣，用超濾提取的方法進(jìn)行粗提取，在進(jìn)行離子交換層析純化，進(jìn)一步的純化洋蔥外泌體，得到較純的洋蔥外泌體，并進(jìn)行抗炎修復(fù)的測試。

5、為實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為一種洋蔥來源外泌體的提取純化方法及制備的外泌體和應(yīng)用，步驟如下：具體而言，本發(fā)明提供了一種洋蔥來源的外泌體，其特征在于，該發(fā)明中洋蔥來源的外泌體是從洋蔥中提取純化而來的，洋蔥來源的外泌體為橢圓形或茶杯狀形態(tài)，并具有碟形、中間凹陷的結(jié)構(gòu)，該囊泡的大小集中在30-200nm之間，平均粒徑在100-130nm之間。

6、s1.對洋蔥進(jìn)行處理，切碎后進(jìn)行研磨，加入緩沖溶液進(jìn)行沖洗和懸浮混合，形成混濁液，加入纖維素酶和果膠酶進(jìn)行混合，后在低溫下進(jìn)行晃動(dòng)混勻處理。

7、s2.過濾去除大顆粒的固體沉淀物，得上清液，對過濾沉淀物再一次清洗，棄沉淀，留上清液，兩次上清液合并。

8、s3.將步驟s2得到的上清液進(jìn)行離心處理，棄沉淀，留上清液。

9、s4.將步驟s3得到的上清液進(jìn)行兩次過濾，第一次進(jìn)行深層過濾，第二次采用小孔徑濾器進(jìn)行過濾。

10、s5.將步驟s4得到的上清液進(jìn)行超濾濃縮后洗濾，得到超濾濃縮洗濾后的外泌體粗提取溶液。

11、s6.將步驟s5得到的外泌體粗提取溶液進(jìn)行離子交換層析，得到純化的洋蔥外泌體。

12、通過利用上述技術(shù)方案，由于洋蔥鱗片葉的外表皮比較厚肉，采用纖維素酶和果膠酶對洋蔥細(xì)胞的細(xì)胞壁進(jìn)行水解和處理，控制纖維素酶和果膠酶的濃度可以保證對洋蔥細(xì)胞壁的的水解，提高酶解的效率，釋放洋蔥細(xì)胞間質(zhì)中的外泌體，通過過濾等步驟去除細(xì)胞組織，獲得含洋蔥外泌體的粗提取液，很好的降低了外泌體樣品的粘稠度，再采用陰離子交換層析色譜柱分離雜質(zhì)，最終陰離子交換層析色譜柱進(jìn)行收集流穿液得到外泌體的最終產(chǎn)品，使外泌體的純度進(jìn)一步提高。

13、優(yōu)選地，所述步驟s1中緩沖液為磷酸鹽緩沖液、tris緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、hepes中的一種或多種，緩沖溶液的濃度為10mmol/l~100mmol/l。

14、優(yōu)選地，所述步驟s1中加入纖維素酶的濃度為0.03%~0.15%之間和果膠酶的濃度為0.05%~0.25%之間，酶解時(shí)間為6h~12h之間，酶解的保持溫度為10℃~20℃，酶解過程中持續(xù)晃動(dòng)。

15、優(yōu)選地，所述步驟s2中過濾大顆粒采用孔數(shù)為60目~200目的紗布。

16、優(yōu)選地，所述步驟s3中離心力為5000g~10000g，溫度為4℃~10℃，時(shí)間為40min~80min。

17、優(yōu)選地，所述步驟s4中第一次濾器為0.02μm~1.5μm孔徑的深層濾器，第二步濾器為pes材質(zhì)，孔徑為0.2μm~0.4μm。

18、優(yōu)選地，所述步驟s5中進(jìn)行超濾濃縮換液，通過超濾膜包或者中空纖維柱進(jìn)行濃縮和洗濾，超濾膜包截留分子量為100kda~1000kda，中空纖維截留分子量為100kda~1000kda。

19、優(yōu)選地，所述步驟s5中緩沖液為磷酸鹽緩沖液、tris緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、hepes中的一種或多種，緩沖溶液的濃度在10mmol/l~100mmol/l。

20、優(yōu)選地，所述步驟s6中所述離子交換層析為弱陰離子交換層析或強(qiáng)陰離子交換層析。

21、優(yōu)選地，所述步驟s6中層析平衡液為磷酸鹽緩沖液、tris緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、hepes中的一種或多種，緩沖溶液的濃度在10mmol/l~100mmol/l。洗脫液為氯化鈉溶液，濃度在1mol/l~2mol/l。

22、優(yōu)選地，為充分去除雜質(zhì)超濾后進(jìn)行洗濾的次數(shù)為5~10次。

23、優(yōu)選地，陰離子交換層析的基質(zhì)為高度交聯(lián)的瓊脂糖微球，配基為季銨鹽或羥基磷灰石，填料平均粒徑范圍為80μm~120μm。

24、優(yōu)選地，處理洋蔥的量為100g~100kg。

25、優(yōu)選地，外泌體層析后得到的外泌體樣品收集為流穿液。

26、本發(fā)明提供了一種洋蔥來源外泌體在皮膚抗炎中的應(yīng)用。

27、本發(fā)明提供了一種洋蔥來源外泌體提取純化的方法，工藝穩(wěn)定，外泌體的質(zhì)量較高，從洋蔥中得到的高純的外泌體可以用于皮膚的抗炎修復(fù)。以適合本試驗(yàn)?zāi)康牡氖茉囌邽閷ο?，在皮膚涂抹樣品前測定面頰的皮膚角質(zhì)a*值，并計(jì)算ita°值，并在使用產(chǎn)品14天和28天后同一部位測定面頰的皮膚角質(zhì)層a*值，并計(jì)算ita°值，對測定的涂抹前后的皮膚角質(zhì)層a*值和ita°值進(jìn)行比較。

28、測試流程d0：（1）清潔臉部和等待，受試者用潔面產(chǎn)品清潔面部，并用干面巾紙擦干皮膚，在溫度、濕度恒定的實(shí)驗(yàn)室中靜坐20-30min。（2）測試受試者皮膚基礎(chǔ)值：實(shí)驗(yàn)室技術(shù)測試員根據(jù)其測試的目的采用cutometer?dual?mpa580?皮膚彈性測試儀、colorimetercl400皮膚色度計(jì)對受試者面頰進(jìn)行測試，每個(gè)區(qū)域平行測定至少3次，并用visia-cr拍照。d14、d28均進(jìn)行相應(yīng)的檢測。

29、功效結(jié)果：與使用之前相比，使用樣品28天后，ita°紫外線值改善率為18.79%。

30、與使用之前相比，使用樣品28天后，a*值抗炎改善率為14.40%。

31、由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明方法得到洋蔥外泌體，其處理容易、工藝容易實(shí)現(xiàn)、用時(shí)較短、質(zhì)成本較低、純度較高，提取純化得到的外泌體純度能夠達(dá)到95%以上，可以用于化妝品應(yīng)用中具有較明顯的抗炎作用。