本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領域，具體涉及人ugt1a4基因多態(tài)性檢測試劑盒及其制備方法和應用。

背景技術：

1、拉莫三嗪(lamotrigine，ltg)是一種用于治療癲癇和雙相情感障礙的抗驚厥藥物。常見的副作用包括嗜睡，頭痛，嘔吐，協(xié)調困難和皮疹。嚴重的副作用包括缺乏紅細胞，導致stevens-johnson綜合征和過敏反應。中國癲癇診療指南、《拉莫三嗪個體化給藥臨床藥師指引》已列出拉莫三嗪治療癲癇的參考濃度范圍和預警值，以及治療雙相情感障礙的預警值，作為劑量調整和預判不良反應的參考。

2、拉莫三嗪ltg主要在肝微粒體經尿苷二磷酸葡糖醛酸轉移酶(ugt)代謝，其中主要的代謝酶為ugt1a4,參與多種內源性物質和外源性物質的代謝。多項ugt1a4*3基因多態(tài)性與拉莫三嗪藥動力學相關的研究，表明ugt1a4*3(142t>g)突變可降低拉莫三嗪血藥濃度。

3、針對ugt1a4*3(142t>g)基因多態(tài)性檢測的方法有多種，主要包含dna直接測序法、核酸質譜分析法、多重pcr結合片段長短分析法。sanger測序法操作復雜,成本較高。cn110184345a和cn113249460a均采用核酸質譜分析方法，發(fā)明提供了一種用于精神疾病或焦慮癥患者用藥指導的基因群檢測試劑盒pannel，cn109825574a采用多重pcr結合片段長短分析法，公開了一種用于抗癲癇治療藥物用藥指導的多重基因檢測試劑盒；其中均包含ugt1a4*3多態(tài)性位點的設計信息，但是此類設計復雜、包含檢測藥物很多、檢測費用相對很高，更適合初步確診患者在選藥試藥前進行大檢查，然而根據臨床信息基本鎖定幾種藥物時，選擇上面的設計和檢查方案可能存在較高的經濟浪費。

4、taqman探針是一種雙標記、自淬滅的水解探針，在pcr反應中加入兩條兩端帶有不同熒光標記的特異探針來識別不同的等位基因。其5’和3’末端分別標記熒光基團和淬滅基團，在探針結構完整時兩者距離較近，熒光基團的信號可被淬滅。在pcr擴增過程中，若taqman探針與靶標序列完全匹配，探針則可結合在dna模板上，此時taq酶延伸至探針位置時，其外切酶活性將切割水解探針，釋放熒光基團，使得熒光信號增強。而且，隨著擴增產物的增多，熒光信號越來越強，從而可通過儀器實時監(jiān)測熒光信號的變化過程。目前市面上暫沒有針對單個位點ugt1a4*3基因多態(tài)性的taqman試劑盒，那么開發(fā)一種檢測ugt1a4*3基因多態(tài)性的產品，以實現高靈敏度高特異性、快速且低成本、更方便快捷的ugt1a4*3基因多態(tài)性檢測是非常必要的。

技術實現思路

1、(一)解決的技術問題

2、針對現有技術中的上述不足，本發(fā)明提供了一種采用pcr熒光探針法(改良版)檢測人ugt1a4*3基因多態(tài)性的試劑盒及其制備方法和應用。該試劑盒能夠精確區(qū)分ugt1a4*3位點的三種基因型，顯著提升了檢測的準確性，并降低了最低檢出限。這一改進使得該試劑在基因分型檢測中的應用更加可靠和高效。用藥前通過基因檢測結合患者臨床及診斷信息，有助于醫(yī)生快速確定給藥方案和藥物劑量，減少患者前期試藥和劑量調整等過程。

3、(二)技術方案

4、為實現以上目的，本發(fā)明通過以下技術方案予以實現：

5、本發(fā)明在一方面，提供了一種用于檢測人ugt1a4*3基因多態(tài)性的引物和探針組合物，用于檢測ugt1a4142t>g位點。包含正向引物f、反向引物r、野生型檢測探針和突變型檢測探針。還包含內標上游引物、內標下游引物和內標探針。

6、在一個方面，本發(fā)明提供了正向引物f、反向引物r、野生型檢測探針和突變型檢測探針的具體序列：正向引物f選自seq?id?no:1-3所示的核苷酸序列；反向引物r選自seq?idno:4-6所示的核苷酸序列；野生型檢測探針選自seq?id?no:7-8所示的核苷酸序列；突變型檢測探針選自seq?id?no:9-10所示的核苷酸序列。

7、在一個方面，本發(fā)明提供了內標上游引物、內標下游引物和內標探針的具體序列：內標上游引物為seq?id?no:11所示的核苷酸序列；內標下游引物為seq?id?no:12所示的核苷酸序列；內標探針為seq?id?no:13所示的核苷酸序列。

8、在一個方面，所有檢測探針5’端均連接發(fā)光報告基團，發(fā)光報告基因選自rox、fam或vic；所有檢測探針3’端均連接磷酸基團和能夠吸收5’端發(fā)射熒光信號的淬滅基團，淬滅基團選自bhq2或nfq。

9、在一個方面，本發(fā)明提供了一種擴增pcr反應溶液，pcr反應溶液包含引物、探針、dntp、tris-hcl、抗體修飾taqdna聚合酶、mgcl2、dutp、37℃非熱敏udg酶、kcl、glycerol、dmso、formamide、triton100等組成成分。

10、在一個方面，本發(fā)明提供了一種人ugt1a4*3基因多態(tài)性的試劑盒，所述試劑盒包括如下組分：樣本裂解液、正向引物、反向引物、野生型檢測探針、突變型檢測探針、內標上游引物、內標下游引物、內標探針、2*pcr反應液、陽性對照和陰性對照。

11、在一個方面，本發(fā)明提供了一種人ugt1a4*3基因多態(tài)性的試劑盒的制備方法，包括如下步驟：將樣本裂解液、正向引物、反向引物、野生型檢測探針、突變型檢測探針、內標上游引物、內標下游引物、內標探針、2*pcr反應液、陽性對照和陰性對照分裝到合適的容器中。

12、在一個方面，本發(fā)明提供一種用于檢測人ugt1a4*3基因多態(tài)性的引物和探針組合物、pcr反應液和試劑盒的應用，所述應用為在制備檢測基因多態(tài)性的檢測試劑或在制備拉莫三嗪用藥指導的試劑中的應用。

13、在一個實施例中，正向引物f優(yōu)選seq?id?no:2所示的核苷酸序列，反向引物r優(yōu)選seq?id?no:6所示的核苷酸序列，野生型檢測探針優(yōu)選seq?id?no:7所示的核苷酸序列，突變型檢測探針優(yōu)選seq?id?no:9所示的核苷酸序列。

14、在一個實施例中，內標探針的5’端連接熒光基團rox，野生型檢測探針的5’端連接熒光基團fam，突變型檢測探針的5’端連接熒光基團vic。內標探針的3’端連接淬滅基團bhq2；野生型檢測探針和突變型檢測探針的3’端連接淬滅基團nfq，探針的3’端加入一個能插入dna小溝的小溝結合物(mgb)。

15、在一個實施例中，試劑盒中正向引物f、反向引物r、野生型檢測探針和突變型探針的比例優(yōu)選f:r:fam:vic＝(0.8):(0.8):(0.125):(0.25)。試劑盒中的防污染系統(tǒng)為37℃非熱敏udg酶和dutp。pcr反應液中dntp的濃度為0.3mm，mgcl2的濃度3mm。pcr反應液還含有5％glycerol、4％dmso、2％formamide和0.3％triton?100。

16、在一個實施例中，陽性對照包括陽性對照w(ugt1a4*1野生型質粒)、陽性對照m(ugt1a4*3突變型質粒)。ugt1a4*1野生型質粒為seq?id?no:14所示的核苷酸序列，ugt1a4*3突變型質粒為seq?id?no:15所示的核苷酸序列。陰性對照為不含核酸的樣本裂解液。

17、在一個實施例中，試劑盒中樣本裂解液的使用方法為：在樣本中添加樣本裂解液，混合均勻后瞬離，置95℃加熱5min，等待冷卻至室溫12000rpm離心2min，上清即可作為上樣溶液。

18、(三)有益效果

19、本發(fā)明提供了人ugt1a4基因多態(tài)性檢測試劑盒及其制備方法和應用。與現有技術相比，具備以下有益效果：

20、1.ugt1a家族基因同源性高度相似，ugt1a4*3多態(tài)性位點野生型和突變型分別設計高特異性探針，3’末端倒數第二或第三位單堿基、末端連續(xù)堿基與同源性序列存在差異點的特殊引物，能夠將ugt1a4*3位點的三種基因型明確區(qū)分，大大提高了檢測試劑的準確度和特異性均能達到100％。

21、2.樣本前處理操作簡便快捷，僅需95℃加熱5min，4000rpm或12000rpm離心2min即可用于后面擴增基因檢測分型。不需要對樣本進行柱式或磁珠法提取核酸，精減樣本前處理復雜的操作過程、降低由長時間開管造成交叉污染幾率、縮短檢測時間同時也節(jié)約樣本處理的經濟成本。

22、3.由于檢測試劑的高特異性高靈敏度和樣本處理試劑釋放細胞內核酸物質，最低檢出限lod值極低。無論正常血液樣本白細胞10^9稀釋1000倍后再進行樣本處理，還是血液樣本經處理后含核酸的上樣溶液稀釋500倍，基因分型檢測仍然能夠精準檢出，靈敏度能夠達到10pg/μl。