本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)，涉及一種人心臟組織來源的成纖維細胞的分離方法。

背景技術：

1、成纖維細胞(fibroblast)是一類存在于結(jié)締組織中的間質(zhì)細胞(mesenchymalcell)。成纖維細胞可以通過分泌膠原蛋白、蛋白聚糖、彈性蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白等多種細胞外基質(zhì)(extracellular?matrix,ecm)成分，從而在組織內(nèi)形成高度有序的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，發(fā)揮調(diào)控組織機械應激、損傷與修復等重要功能。心臟富含大量的成纖維細胞，主要分布于心肌細胞間隙、心外膜和心內(nèi)膜。其中，起源自心外膜和心內(nèi)膜上皮的成纖維細胞，約占成年人類心臟總細胞數(shù)量的60％-70％。心臟成纖維細胞在生理和病理條件下發(fā)揮重要的調(diào)控功能。在生理條件下，心臟成纖維細胞負責構(gòu)成心臟的細胞外基質(zhì)網(wǎng)絡，保持心肌組織和心臟結(jié)構(gòu)的完整性，維持正常的電傳導和心跳節(jié)律。在病理條件下，成纖維細胞在機械張力和細胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子β(transforg?growth?factorβ,tgf-β)等多重因素的影響下，激活、增殖并進一步分化為肌成纖維細胞以維持心臟結(jié)構(gòu)的完整，保障心臟功能的穩(wěn)定。然而，成纖維細胞的過度激活會導致過量的胞外基質(zhì)及纖維組分沉積，形成纖維化疤痕，造成心臟收縮和舒張功能不全，最終引起心力衰竭甚至死亡。成纖維細胞在心肌組織修復和再生中也發(fā)揮關鍵性作用。已有研究顯示，通過心肌細胞原位重編程技術，可將形成瘢痕的成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為誘導樣心肌細胞，從而有效再生新的心肌組織，并縮小梗死面積、改善心臟功能。

2、高質(zhì)量的心臟成纖維細胞在基礎生物學研究、再生醫(yī)學研究以及臨床應用中具有如下重要意義：1、研究心臟成纖維細胞增殖、分化、凋亡等機理，對于理解心臟發(fā)育、纖維化等生理和病理過程至關重要。2、通過調(diào)節(jié)成纖維細胞的活性可以減輕心臟纖維化，改善心臟功能，有助于揭示心臟疾病的發(fā)病機制，為診斷和治療提供新的靶點。3、通過研究成纖維細胞的功能和調(diào)控機制，可以開發(fā)新的治療策略，促進受損組織的修復和再生，為再生醫(yī)學提供理論基礎和實驗依據(jù)。

3、膠原蛋白是心臟組織胞外基質(zhì)主要的構(gòu)成成分，主要由i型、ⅲ型纖維狀膠原以及ⅳ、ⅴ和ⅵ型膠原等組成。在正常哺乳動物心臟中i型和ⅲ型膠原蛋白大量表達，占心臟膠原蛋白的90-95％。不同類型的膠原蛋白在結(jié)構(gòu)上都具備由甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸組成的三螺旋結(jié)構(gòu)域，從而讓膠原蛋白有較高的拉伸強度和抗蛋白水解能力。由于心臟組織胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)致密，從心臟中分離細胞時通常需使用各種消化酶并伴隨震蕩、渦旋等機械手段輔助消化。

4、常用消化酶包括胰蛋白酶(trypsin)及膠原酶(collogenase)。胰蛋白酶是一種常見的通用型消化酶，主要通過水解賴氨酸(lys)與精氨酸(arg)之間的肽鍵，減少細胞間連接，從而達到消化細胞的目的。胰蛋白酶無底物特異性，對組織和細胞的作用強烈，實際使用的過程中需密切關注胰蛋白酶的用量及消化時間。若其消化用量和消化時間不恰當，將會導致組織過度解離，造成細胞損傷甚至死亡。心臟成纖維細胞為貼壁生長的細胞，分離過程中消化不全或過度消化都將引起細胞活性、細胞貼壁能力及細胞功能的改變，進而影響研究結(jié)果。因此，如何獲得高活性、高質(zhì)量的心臟成纖維細胞是心臟研究領域的重點和難點。

5、膠原酶通過特異性識別底物中的pro-x-gly-pro序列，切割該序列中的中性氨基酸(x)和甘氨酸(gly)之間的肽鍵，從而實現(xiàn)蛋白切割及降解。膠原酶ⅱ，主要酶作用底物包括i型膠原蛋白、ⅲ型膠原蛋白、纖連蛋白等，該酶被還原劑和ca2+激活后顯示出與胰蛋白酶不同的底物特異性，可以與其他蛋白酶互補進一步完善酶混合物，更利于肝臟、骨、甲狀腺、心臟和唾液腺組織細胞的分離。膠原酶ⅳ，其主要酶作用底物是i型膠原蛋白，并且該酶含有低胰蛋白酶活性，可以降低對膜蛋白和細胞表面受體的損害。

6、目前已報道分離小鼠心臟成纖維細胞的方法主要有兩種：酶解消化法和組織塊貼壁法。分離小鼠心臟成纖維細胞的過程中，申請公開號為cn?110358723?a的發(fā)明專利中公開了酶解消化法的具體步驟，其使用0.1％ⅱ型膠原酶置于恒溫搖床內(nèi)進行酶解消化。僅使用ⅱ型膠原酶，作用效果較為單一，消化不充分。申請公開號為cn?114921402?a的發(fā)明專利中公開了另一種酶解消化法，包括使用0.5-7.0g/l胰蛋白酶、0.8-10.0g/lⅱ型膠原酶、0.15-2.0g/l?i型脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease,dnase)進行震蕩消化。其中，胰蛋白酶不能專門針對膠原蛋白進行水解，消化效率較低，震蕩消化過程中會產(chǎn)生機械剪切力對細胞造成損傷。這兩種消化方式所得到的成纖維細胞活力和增殖能力不高。另外一種分離方法是組織塊貼壁法，利用心臟組織貼附特性使其固定于培養(yǎng)皿中，心臟成纖維細胞會遷移出來，但遷移周期較長，成纖維細胞增殖遷移后其細胞原有基質(zhì)成份會發(fā)生改變，并導致成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，由此引起的細胞異質(zhì)性會對后續(xù)實驗造成很大影響。

7、綜上所述，高質(zhì)量的人原代心臟成纖維細胞是基礎科研實驗中極為緊缺且迫切需要的工具細胞。不同的細胞對于酶的耐受能力存在差異，在各種不同配比的酶溶液中，其存活率也各不相同。當前，尚未報道能夠分離人原代心臟成纖維細胞的有效方法。

技術實現(xiàn)思路

1、人來源的原代心臟成纖維細胞能更接近體內(nèi)實際情況，細胞來源更為明確，分離得到高質(zhì)量的人原代心臟成纖維細胞成為許多心臟研究領域的限速步驟。本發(fā)明的目的在于提供一種人心臟組織來源的成纖維細胞的分離方法。本發(fā)明分離得到的人心臟成纖維細胞在細胞培養(yǎng)、篩選和測試新藥物、提供高質(zhì)量細胞來源等方面有廣闊應用前景。

2、本發(fā)明目的通過以下技術方案來實現(xiàn)：

3、一種人心臟組織來源的成纖維細胞的分離方法，包括以下步驟：將心臟組織用含膠原酶ⅱ和膠原酶ⅳ的消化液靜置消化；消化后的組織用紅細胞裂解液裂解，裂解后的組織用緩沖液重懸，離心、棄上清得到人心臟成纖維細胞。其中，所述的消化液中膠原酶ⅱ、膠原酶ⅳ的濃度均優(yōu)選為0.20-0.30mg/ml，進一步優(yōu)選為0.25mg/ml。

4、在一些實施方案中，所述的消化液為含0.25mg/ml膠原酶ⅱ、0.25mg/ml膠原酶ⅳ的細胞培養(yǎng)基，所述的細胞培養(yǎng)基優(yōu)選為rpmi-1640培養(yǎng)基。進一步的，所述的消化液中還可含有青霉素-鏈霉素、dnase、β-巰基乙醇，各濃度分別優(yōu)選為100u/ml青霉素-鏈霉素、1mg/ml?dnase、0.05mmβ-巰基乙醇。

5、在一些實施方案中，1g心臟組織優(yōu)選使用3ml消化液，靜置消化2-4小時。其中，心臟組織用無菌手術剪及無菌刀片切割成糊狀。

6、在一些實施方案中，所述的紅細胞裂解液的組成優(yōu)選為：0.15m氯化銨、0.1m乙二胺四乙酸二鈉、10mm碳酸氫鉀；裂解的條件優(yōu)選為冰上裂解0.5-1分鐘。

7、在一些實施方案中，所述的facs?buffer緩沖液為含2％(v/v)胎牛血清、2.5mm乙二胺四乙酸(edta)的1×杜氏磷酸緩沖鹽溶液(dpbs)。

8、進一步的，所述的人心臟組織來源的成纖維細胞的分離方法，包括以下步驟：

9、(1)無菌環(huán)境下，心臟組織用無菌手術剪和鑷子剪除多余的脂肪、血管等其他組織，剪成小塊，用預冷的洗滌液沖洗心臟多次。

10、所述的洗滌液優(yōu)選為含100u/ml青霉素-鏈霉素的1×dpbs。

11、(2)用無菌手術剪將心臟組織塊剪成碎塊，再用無菌刀片切割成糊狀，將切碎后的組織塊1g/孔轉(zhuǎn)移至6孔板中。

12、(3)向6孔板的孔中加入3ml消化液覆蓋組織塊，輕輕吹散。

13、(4)將6孔板置于37℃的5％?co2的恒溫培養(yǎng)箱中消化2-4小時，直至完全消化。

14、(5)取消化后的組織，將其完全吹散，使用細胞篩網(wǎng)過濾至離心管中。

15、(6)過濾得到的組織混合離心后吸棄上清，加入紅細胞裂解液避光條件下低溫裂解后加入facs?buffer重新懸浮細胞沉淀。所述的離心的條件優(yōu)選為600g(rcf)離心10分鐘。

16、(7)將步驟(6)得到的組織混合液離心、棄上清，所得細胞沉淀即為分離得到的人心臟成纖維細胞。所述的離心的條件優(yōu)選為600g(rcf)離心5分鐘。

17、進一步的，所述的人心臟組織來源的成纖維細胞的分離方法，還包括以下步驟：分離得到的人心臟成纖維細胞用人心臟成纖維細胞培養(yǎng)基重新懸浮，得到可以貼壁培養(yǎng)的人原代心臟成纖維細胞。

18、所述的人心臟成纖維細胞培養(yǎng)基優(yōu)選為含20％(v/v)胎牛血清、100u/ml青霉素-鏈霉素的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco's?modified?eagle?medium,dmem)。

19、本發(fā)明首次分離出人來源的原代心臟成纖維細胞，具有如下優(yōu)點和有益效果：1、首次建立了人心臟成纖維細胞消化方案：確定了ⅳ型膠原酶和ⅱ型膠原酶最佳固定配比，利用了不同酶的酶消化活力和底物特異性，提高了組織消化效率。2、在消化條件方面，首次采用了靜置消化法，避免了渦旋法與震蕩消化法對細胞的機械損傷。3、首次提供了消化液與組織的搭配比例及固定消化容器面積，以每個6孔板的一個孔(9.62cm2)為空間基礎，以每1g組織使用3ml消化液為基準，最佳消化時間為2-4小時?？傊@樣的消化方式，減弱了物理機械力對細胞原有狀態(tài)的破壞，通過多類型膠原酶的結(jié)合和比例搭配，充分消化心臟組織，成功分離出高活性的、可貼壁生長及傳代的人原代心臟成纖維細胞。將分離產(chǎn)物貼壁培養(yǎng)2-4天后即可得到胞質(zhì)飽滿，細胞核完整的人心臟成纖維細胞，避免了對組織過度消化而導致的細胞活性低、細胞形態(tài)不佳、細胞得率低、細胞增殖生長緩慢、細胞培養(yǎng)困難等問題。本發(fā)明提供的方法操作便捷、分離時間短、實用性強、細胞得率高、細胞質(zhì)量高。所獲得的人來源的原代心臟成纖維細胞，純度高，結(jié)構(gòu)功能完整，細胞狀態(tài)良好。本發(fā)明有助于從人體心臟內(nèi)獲得原代心臟成纖維細胞，有助于體外構(gòu)建相關心血管疾病模型，研究心臟纖維化發(fā)生發(fā)展機制，并為篩選和鑒定小分子靶向藥物提供良好的細胞來源與研究基礎。