本發(fā)明屬于熒光探針檢測(cè)及納米載藥應(yīng)用，更加具體地說，涉及一種喹啉酰肼席夫堿自組裝形成的納米熒光探針在檢測(cè)hsa中的應(yīng)用，以及進(jìn)一步用于對(duì)hsa構(gòu)成的納米顆粒進(jìn)行熒光標(biāo)記以實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物分子分布和代謝進(jìn)行示蹤的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、人血清白蛋白（hsa）是一種分子量為66.5kda的心形單鏈蛋白，臨床上常用于治療出血、休克、燒傷、紅細(xì)胞增多、低白蛋白血癥等癥狀。hsa可以作為生物標(biāo)志物，在人類健康監(jiān)測(cè)中發(fā)揮重要作用。其在血液中的正常濃度約為35-55g/l，健康個(gè)體尿液中的濃度應(yīng)低于30mg/l。精確追蹤疾病相關(guān)蛋白的含量和活性對(duì)于臨床診斷、藥物毒性監(jiān)測(cè)和疾病治療至關(guān)重要。微量白蛋白尿是糖尿病、高血壓、心血管疾病和腎臟疾病的早期指標(biāo)。血漿中hsa水平低，即低白蛋白血癥，可能意味著肝硬化、肝功能衰竭和慢性肝炎。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)體液中的hsa水平至關(guān)重要。

2、作為可溶性載體蛋白，hsa在血液中含量最為豐富，占血漿總蛋白含量的52%-60%。它在維持血液滲透壓、運(yùn)輸各種物質(zhì)以及結(jié)合激素、維生素、脂肪酸、鈣離子和藥物分子方面起著至關(guān)重要的作用。hsa作為藥物載體具有優(yōu)異的生物利用度。由于其在體內(nèi)分布廣泛、無(wú)毒、無(wú)抗原性、可生物降解，它不會(huì)在患者中引起排斥反應(yīng)。同時(shí)，藥物與hsa的結(jié)合可以減少藥物負(fù)荷和毒性，最大限度地提高治療效果。hsa可以與水溶性較差的藥物結(jié)合，促進(jìn)藥物在體內(nèi)的均勻分布，延緩藥物代謝，延長(zhǎng)藥物療效的循環(huán)時(shí)間。鉑類藥物在癌癥治療中得到了廣泛而有效的應(yīng)用，基于hsa的鉑類藥物遞送系統(tǒng)在臨床試驗(yàn)中顯示出了良好的應(yīng)用前景。研究載鉑藥物的hsa納米顆粒在生物體內(nèi)的代謝和分布對(duì)于藥物開發(fā)、臨床應(yīng)用和提高患者治療效果具有重要意義。通過將熒光探針分子與hsa結(jié)合，可以對(duì)hsa納米載體在生物系統(tǒng)中進(jìn)行熒光追蹤。隨后，隨著hsa的分解，熒光分子將失去其熒光特性。因此，可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)體內(nèi)藥物輸送和代謝的目的。

3、傳統(tǒng)的hsa檢測(cè)和分析方法包括染料結(jié)合法、熒光免疫測(cè)定法、lc-ms、電泳法等。這些方法通常需要高昂的材料和儀器成本，涉及復(fù)雜的樣品制備，特異性和抗干擾能力較差。小分子熒光探針已被證明是一種有前景的選擇，它們具有易于制備、檢測(cè)快速方便、非侵入性和在生物分子檢測(cè)中的非破壞性等優(yōu)點(diǎn)。到目前為止，已經(jīng)開發(fā)了各種hsa探針，用于選擇性和靈敏地檢測(cè)生物樣本中可能存在的hsa，但仍存在一些局限性。例如，某些hsa探針顯示出較差的水溶性，這阻礙了它們?cè)谏锃h(huán)境中的應(yīng)用。此外，一些探針與蛋白質(zhì)的氨基或巰基共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致hsa變性。大多數(shù)hsa熒光探針結(jié)合到兩個(gè)經(jīng)典的hsa藥物結(jié)合位點(diǎn)，位點(diǎn)i和位點(diǎn)ii，因此體內(nèi)常用的藥物分子會(huì)對(duì)熒光檢測(cè)造成嚴(yán)重干擾。開發(fā)用于定性和定量檢測(cè)hsa的新型小分子探針具有巨大的實(shí)用價(jià)值和研究意義。近年來，分子自組裝hsa探針已成為構(gòu)建軟功能材料的有力工具，在材料科學(xué)和生物學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用。小分子有機(jī)染料可以在沒有納米載體的情況下直接組裝成納米粒子，表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性和生物相容性，并且在分子設(shè)計(jì)方面提供了廣泛的靈活性。喹啉作為熒光團(tuán)具有高熒光量子產(chǎn)率、大斯托克斯位移、高光穩(wěn)定性、良好的生物相容性和可調(diào)熒光特性等優(yōu)勢(shì)；酰胺基可以增加與hsa的結(jié)合親和力；對(duì)其進(jìn)行組裝設(shè)計(jì)，使酰肼席夫堿化合物的不同官能團(tuán)表現(xiàn)出不同的親水性和親脂性；都有利于合成出的熒光探針作為hsa化學(xué)傳感器的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的喹啉酰肼席夫堿自組裝形成的納米熒光探針，可以作為高靈敏度、高選擇性的hsa熒光分析手段，和現(xiàn)有文獻(xiàn)中的探針（化合物）相比較，本發(fā)明的自組裝納米熒光探針具有優(yōu)異的選擇性、良好的抗干擾能力、快速響應(yīng)、高靈敏度、生物相容性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、制備簡(jiǎn)單、合成成本低等優(yōu)勢(shì)。喹啉酰肼席夫堿與hsa構(gòu)筑的納米顆粒，可以作為可視化的載體運(yùn)載鉑類藥物。其優(yōu)勢(shì)為在光激發(fā)下可發(fā)射熒光，從而對(duì)納米顆粒起到示蹤作用。納米顆粒解離后熒光消失，可監(jiān)控鉑類藥物在生物體系內(nèi)的釋放。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容：

3、一種喹啉酰肼席夫堿熒光探針，其特征在于，具有如下所示結(jié)構(gòu)式：

4、

5、本發(fā)明進(jìn)一步公開了所述喹啉酰肼席夫堿熒光探針的制備方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行：

6、（1）將喹啉-2-甲酸溶解于無(wú)水乙醇中，然后加入適量濃硫酸加熱回流5-7?h，待反應(yīng)體系冷卻后，用飽和nahco3溶液調(diào)節(jié)ph值至6-9，用二氯甲烷萃取，取二氯甲烷層旋蒸除去溶劑，得固體喹啉-2-甲酸乙酯；

7、（2）將喹啉-2-甲酸乙酯溶解于甲醇，隨后在攪拌中逐滴加入水合肼，加熱攪拌，冷凝回流反應(yīng)1?h，tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)至喹啉-2-甲酸乙酯反應(yīng)完全停止反應(yīng)；待反應(yīng)液冷卻至室溫后，真空減壓濃縮，加入甲醇、乙醇循環(huán)交替旋蒸至反應(yīng)體系中水合肼被蒸發(fā)除去，得到喹啉-2-甲酰肼，其中喹啉-2-甲酸乙酯和水合肼的物質(zhì)的量之比為1:15-30；

8、（3）將喹啉-2-甲酰肼溶解于無(wú)水甲醇中，另將2，4-二羥基苯甲醛溶解于無(wú)水甲醇，在攪拌下緩緩滴加至喹啉-2-甲酰肼的甲醇溶液，加熱攪拌，冷凝回流反應(yīng)9.5?h，將反應(yīng)液冷卻至室溫后，抽濾并洗滌沉淀，真空干燥得反應(yīng)產(chǎn)物即該喹啉酰肼席夫堿熒光探針；其中喹啉-2-甲酰肼和2，4-二羥基苯甲醛的投料物質(zhì)的量比為1:1。

9、本發(fā)明更進(jìn)一步公開了所述喹啉酰肼席夫堿熒光探針在用于hsa定性和定量檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于喹啉酰肼席夫堿熒光探針在pbs緩沖液中形成自組裝納米熒光探針；pbs緩沖液的ph?=?7-8。將hsa加入到所述探針溶液中，在365?nm?紫外燈下，溶液由無(wú)色變?yōu)榍嗌瑢?shí)現(xiàn)對(duì)hsa的快速檢測(cè)。另外在370-420?nm激發(fā)光下，本身幾乎沒有熒光信號(hào)，與hsa作用后，在495?nm處產(chǎn)生很強(qiáng)的青色熒光信號(hào)，且對(duì)hsa的定量檢測(cè)濃度范圍為0-8?mm，檢測(cè)限為8.49?nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：喹啉酰肼席夫堿熒光探針對(duì)于hsa具有良好的檢測(cè)能力，靈敏性高，熒光強(qiáng)度與濃度具有良好的線性關(guān)系，可準(zhǔn)確的定量測(cè)量hsa濃度。

10、本發(fā)明也公開了喹啉酰肼席夫堿熒光探針在用于檢測(cè)活細(xì)胞和生物樣品中hsa方面的應(yīng)用。主要是喹啉酰肼席夫堿熒光探針與hsa形成納米顆粒，用于檢測(cè)氯代血紅素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：熒光探針與hsa形成的納米顆粒可定量檢測(cè)氯代血紅素，檢測(cè)限低，靈敏性好。

11、本發(fā)明還公開了喹啉酰肼席夫堿熒光探針與hsa形成熒光示蹤的納米顆粒，在用于運(yùn)載鉑類藥物中的應(yīng)用。其合成方法按如下反應(yīng)制備：

12、將1?mm，hsa水溶液加入pbs緩沖液中，在高速攪拌下用移液管槍將1?mm探針分子的dmf溶液緩慢加入hsa溶液中，將上述溶液裝入已煮沸并活化過濾的透析袋中，用pbs緩沖液透析2小時(shí)，以從系統(tǒng)中去除單分子和小顆粒；然后用移液器從透析袋中提取樣品，并用少量pbs緩沖液沖洗袋內(nèi)，確保樣品的完全轉(zhuǎn)移，所得溶液密封在冰箱中4°c保持。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：熒光探針與hsa形成的納米顆粒具有良好的熒光性能，可穩(wěn)定的運(yùn)載鉑類藥物，納米顆粒解離后熒光消失，可實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物載體的監(jiān)控。

13、本發(fā)明更加詳細(xì)的內(nèi)容如下

14、本發(fā)明作為hsa檢測(cè)和鉑類藥物的熒光示蹤載體的應(yīng)用通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

15、用于hsa檢測(cè)的喹啉酰肼席夫堿自組裝形成的納米熒光探針，具有如下所示的結(jié)構(gòu)式：

16、

17、所述喹啉酰肼席夫堿形成的自組裝納米熒光探針用于對(duì)hsa的定性和定量檢測(cè)方面的應(yīng)用。

18、所述喹啉酰肼席夫堿形成的自組裝納米熒光探針的合成具體如下：

19、（1）將喹啉-2-甲酸溶解于無(wú)水乙醇中，然后加入適量濃硫酸加熱回流5-7?h，待反應(yīng)體系冷卻后，用飽和nahco3溶液調(diào)節(jié)ph值至6-9，用二氯甲烷萃取，取二氯甲烷層旋蒸除去溶劑，得到喹啉-2-甲酸乙酯。

20、（2）將喹啉-2-甲酸乙酯溶解于甲醇，隨后在攪拌中逐滴加入水合肼（n2h4·h2o），加熱攪拌，冷凝回流反應(yīng)1?h。tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)至喹啉-2-甲酸乙酯反應(yīng)完全（石油醚：乙酸乙酯=?5：1），停止反應(yīng)。待反應(yīng)液冷卻至室溫后，真空減壓濃縮，加入甲醇、乙醇循環(huán)交替旋蒸至反應(yīng)體系中水合肼被蒸發(fā)除去，得到喹啉-2-甲酰肼。

21、所述（2）中喹啉-2-甲酸乙酯和水合肼投料的物質(zhì)的量之比為1:(15-30)。

22、（3）將喹啉-2-甲酰肼溶解于無(wú)水甲醇中，另將2，4-二羥基苯甲醛溶解于甲醇，在攪拌下緩緩滴加至喹啉-2-甲酰肼的甲醇溶液，加熱攪拌，冷凝回流反應(yīng)9.5?h。將反應(yīng)液冷卻至室溫后，抽濾并洗滌沉淀，真空干燥得反應(yīng)產(chǎn)物即該喹啉酰肼席夫堿熒光探針。

23、所述（3）中喹啉-2-甲酰肼和2，4-二羥基苯甲醛的投料物質(zhì)的量比為1:1。

24、所述的合成路線如下：

25、

26、所述喹啉酰肼席夫堿在pbs緩沖液中形成自組裝納米熒光探針。

27、所述pbs緩沖液的ph?=?7-8。

28、所述喹啉酰肼席夫堿自組裝形成的納米熒光探針，在激發(fā)波長(zhǎng)范圍為370-420?nm激發(fā)下，探針本身幾乎沒有熒光信號(hào)，與hsa作用后，在495?nm處產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號(hào)，且對(duì)hsa的定量檢測(cè)濃度范圍為0-8?mm，檢測(cè)限為8.49?nm。

29、所述喹啉酰肼席夫堿自組裝形成的納米熒光探針，激發(fā)波長(zhǎng)范圍是370-420?nm，發(fā)射波長(zhǎng)約為495?nm，與hsa的結(jié)合位點(diǎn)為fa1位點(diǎn)，有效的克服了水溶性差和常見藥物分子的干擾等缺點(diǎn)，對(duì)hsa有很好的選擇性，可以用于生物體系中hsa的檢測(cè)。