本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種根據(jù)keap1蛋白篩選抗氧化肽的方法及抗氧化肽產(chǎn)品。

背景技術(shù)：

1、活性氧(ros)是正常細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物。雖然一定水平的ros對生理過程是必不可少的，但它們的過度積累會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，損害人體的健康。氧化應(yīng)激會導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)、脂質(zhì)過氧化、rna和dna損傷等有害影響，從而發(fā)展為慢性疾病?？寡趸瘎┦且环N能夠捕獲和中和ros，從而減輕其對人體的有害損傷的物質(zhì)。因此，在食品和藥物中補(bǔ)充抗氧化劑是對抗過量ros損傷的首選策略?？紤]到人工抗氧化劑對健康的不利影響，如致癌作用、高成本等，人們越來越傾向于探索天然、高效和無毒的替代品。在天然食物來源中尋找安全的抗氧化肽尤為重要。這些多肽可以通過微生物發(fā)酵、消化酶解、化學(xué)合成等多種途徑得到，并且大多具有抗氧化活性的多肽是由2-20個氨基酸組成，分子量在500-1500da之間，含有一定量的疏水氨基酸、芳香族氨基酸，同時在n端或c端區(qū)域中疏水氨基酸的存在也可以增強(qiáng)多肽的抗氧化活性。

2、抗氧化肽作為食品科學(xué)和營養(yǎng)學(xué)的研究熱點(diǎn)，可以通過清除自由基、抑制過氧化物和螯合金屬離子來發(fā)揮作用。因此，如何有效地發(fā)現(xiàn)和篩選抗氧化肽已成為研究和生產(chǎn)中的關(guān)鍵問題。傳統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)方法耗時且昂貴，對解決抗氧化肽的定量構(gòu)效關(guān)系也具有挑戰(zhàn)性。一些新技術(shù)，包括分子對接、人工智能(ai)、生物信息學(xué)等，正作為解決傳統(tǒng)方法帶來的問題提供了新思路。這些新技術(shù)具有發(fā)現(xiàn)抗氧化肽的有效能力，即具有高通量篩選的潛力。此外，結(jié)合這些新技術(shù)可以克服單一技術(shù)的缺點(diǎn)，從而提高效率和擴(kuò)大發(fā)現(xiàn)范圍。其中，分子對接是評價抗氧化活性、闡明抗氧化機(jī)制和預(yù)測抗氧化肽定量構(gòu)效關(guān)系的有效方法。更為重要的是分子對接預(yù)測了抗氧化肽與信號通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合的能力。keap1-nrf2信號通路是其主要的代表?？寡趸耐ㄟ^與keap1的kelch結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻斷keap1-nrf2的相互作用，釋放nrf2易位到細(xì)胞核。nrf2與抗氧化反應(yīng)元件(are)結(jié)合，促進(jìn)抗氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗氧化作用。

3、中國專利cn202211407894.7公開了一種基于分子模擬技術(shù)的牛乳清蛋白源抗氧化肽的篩選，中國專利cn202410486383.1公開了一種人工合成的抗氧化肽pep9及其應(yīng)用，中國專利cn202211404356.2公開了一種基于老年人靜態(tài)消化模型的乳清蛋白源抗氧化肽的篩選。分子對接作為一個預(yù)測抗氧化肽的抗氧化能力和機(jī)制常用的方法，是一種強(qiáng)大的技術(shù)。它可以將大量的候選肽縮小到少量，促進(jìn)將來更有針對性的實(shí)驗(yàn)研究，不僅節(jié)省了大量的實(shí)驗(yàn)時間，而且可以更有效地利用有限的研究資源。然而，將分子對接技術(shù)與細(xì)胞水平驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)合篩選抗氧化肽的發(fā)明專利報(bào)道不多。因此，研發(fā)一種基于分子對接和細(xì)胞層面的研究手段篩選出抗氧化肽的方法，對進(jìn)一步認(rèn)識多肽的抗氧化作用機(jī)制有一定的指導(dǎo)意義，能夠?yàn)楹罄m(xù)篩選抗氧化肽提供了一定的理論基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足和實(shí)際需求，本發(fā)明提供了一種根據(jù)keap1蛋白篩選抗氧化肽的方法及抗氧化肽產(chǎn)品。本發(fā)明提供的方法利用分子對接的方法驗(yàn)證肽與keap1活性位點(diǎn)的結(jié)合能力，選擇與keap1活性位點(diǎn)能互相結(jié)合的肽，即為抗氧化肽。采用該方法篩選得到的抗氧化肽通過氫鍵、范德華力和烷基相互作用與keap1活性位點(diǎn)結(jié)合，通過激活keap1-nrf2通路，增強(qiáng)細(xì)胞對h2o2誘導(dǎo)的氧化損傷的抗性，從而發(fā)揮抗氧化作用。所述抗氧化肽具有較好的抗氧化活性，具有安全無毒的特點(diǎn)，對開發(fā)具有抗氧化功能和抗衰老功能的產(chǎn)品具有十分重要的意義。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案包括：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種根據(jù)keap1蛋白篩選抗氧化肽的方法，所述的方法包括：利用分子對接的方法驗(yàn)證肽與keap1活性位點(diǎn)的結(jié)合能力，選擇與keap1活性位點(diǎn)能互相結(jié)合的肽，即為抗氧化肽。

4、具體地，所述的抗氧化肽為抗氧化肽valalare和/或抗氧化肽leaspev。

5、優(yōu)選地，所述的抗氧化肽valalare具有如seq?id?no.1所示的氨基酸序列。seq?idno.1：valalare。

6、優(yōu)選地，所述的抗氧化肽leaspev具有如seq?id?no.2所示的氨基酸序列。seq?idno.2：leaspevi。

7、具體地，所述的keap1活性位點(diǎn)包括：ala366、ala607、arg326、aly466、asn469、cys368、gln563、gly509、gly564、his562、ile559、leu365、leu468、thr560、val369、val418、val463、val467、val512、val514、val561中的一種或多種。

8、優(yōu)選地，所述的抗氧化肽valalare與val512、val467、gly564、gln563、arg326、val418、leu468、ala607、ala466、cys368、ala366、asn469、thr560和his562結(jié)合。

9、優(yōu)選地，所述的抗氧化肽leaspev與val514、arg326、val512、val467、val561、ala607、cys368、ile559、val369、val418、val608、val463、gly509、leu365和ala466結(jié)合。

10、優(yōu)選地，所述的肽與keap1活性位點(diǎn)的結(jié)合方式包括：氫鍵、范德華力和烷基相互作用中的一種或多種。

11、第二方面，本發(fā)明提供了上述方法篩選得到的抗氧化肽，所述的抗氧化肽為抗氧化肽valalare，具有如seq?id?no.1所示的氨基酸序列。

12、第三方面，本發(fā)明提供了上述方法篩選得到的抗氧化肽，所述的抗氧化肽為抗氧化肽leaspevi，具有如seq?id?no.2所示的氨基酸序列。

13、第四方面，本發(fā)明提供了編碼上述抗氧化肽的核苷酸，所述的抗氧化肽為抗氧化肽valalare和/或抗氧化肽leaspevi。

14、第五方面，本發(fā)明提供了上述抗氧化肽的制備方法，所述的抗氧化肽為抗氧化肽valalare和/或抗氧化肽leaspevi。

15、優(yōu)選地，所述的制備方法為：通過固相合成法制備。

16、第六方面，本發(fā)明提供了上述抗氧化肽在制備抗氧化產(chǎn)品或抗衰老產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述的抗氧化肽為抗氧化肽valalare和/或抗氧化肽leaspevi。

17、優(yōu)選地，所述的抗氧化產(chǎn)品包括食品添加劑、保健品、藥品或化妝品。

18、優(yōu)選地，所述的抗衰老產(chǎn)品包括藥品或化妝品。

19、第七方面，本發(fā)明提供了一種抗氧化產(chǎn)品，所述的抗氧化產(chǎn)品包含上述抗氧化肽，所述的抗氧化產(chǎn)品包括食品添加劑、保健品、藥品或化妝品，所述的抗氧化肽為抗氧化肽valalare和/或抗氧化肽leaspevi。

20、第七方面，本發(fā)明提供了一種抗氧化產(chǎn)品，所述的抗氧化產(chǎn)品包含上述抗氧化肽，所述的抗氧化產(chǎn)品包括食品添加劑、保健品、藥品或化妝品，所述的抗氧化肽為抗氧化肽valalare和/或抗氧化肽leaspevi。

21、本發(fā)明的有益效果為：

22、(1)本發(fā)明采用分子對接的方法驗(yàn)證兩種抗氧化肽valalare和leaspevi與keap1活性位點(diǎn)的結(jié)合模式，結(jié)果表明，抗氧化多肽與keap1蛋白匹配較好，結(jié)合能力強(qiáng)，說明兩種多肽是潛在的抗氧化多肽，其中多肽與keap1的ala607、val514和asn469氨基酸殘基的結(jié)合未見報(bào)道過。

23、(2)以往的專利所分離的抗氧化肽大多數(shù)為混合物，同時在細(xì)胞層面的抗氧化活性也未體現(xiàn)，而本發(fā)明所分離純化的抗氧化多肽在細(xì)胞層面的活性評價較好，從而證明了本發(fā)明所提供的抗氧化多肽的功能性更加完善，使發(fā)明更具有說服性。