本發(fā)明屬于細(xì)菌檢測(cè)，尤其涉及一種耐碳青酶烯類腸桿菌科細(xì)菌敏感性檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、細(xì)菌耐藥性已成為全球性關(guān)注的問題，耐藥細(xì)菌所致感染己成為臨床抗感染治療的新挑戰(zhàn)。腸桿菌科細(xì)菌分布廣，與人類關(guān)系密切，并且腸桿菌是重要的醫(yī)院感染菌，碳青霉烯類抗生素是治療腸桿菌感染的主要抗生素，但近年來，隨著碳青霉烯類抗菌藥的大量使用，臨床出現(xiàn)碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌(carbapenem?resistantenterobacteriaceae，cre)。通常cre分為兩種：產(chǎn)碳青霉烯酶的cre(cp-cre)和不產(chǎn)碳青霉烯酶的cre(non-cp-cre)。具體地，在臨床上產(chǎn)碳青霉烯酶的cre常見的主要有kpc型、ndm型等。

2、目前，對(duì)于對(duì)碳青酶烯類耐藥的腸桿菌科細(xì)菌(cre)的感染，臨床常使用替加環(huán)素進(jìn)行治療，但是由于替加環(huán)素的毒副作用，臨床往往不能大劑量長(zhǎng)時(shí)間使用，而且，替加環(huán)素作為抗感染治療的最后防線之一，臨床也會(huì)謹(jǐn)慎使用。除了替加環(huán)素，還有頭孢他啶/阿維巴坦(cza)，頭孢他啶/阿維巴坦+氨曲南(cza+atm)，以及依拉環(huán)素(erv)等。由于頭孢他啶/阿維巴坦只對(duì)常見的kpc型(例如kpc-2型)cre有抑菌效果，當(dāng)出kpc基因突變菌株時(shí)，細(xì)菌會(huì)對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦耐藥，以至于會(huì)導(dǎo)致一些檢測(cè)方法出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果，例如通過pcr方法檢測(cè)kpc基因來判斷細(xì)菌對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦的敏感性。當(dāng)出現(xiàn)對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦耐藥菌株時(shí)，臨床往往可以使用頭孢他啶/阿維巴坦+氨曲南進(jìn)行聯(lián)合治療，但是有研究發(fā)現(xiàn)部分ndm型cre菌株對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦+氨曲南耐藥，且耐藥機(jī)制暫時(shí)不清楚。這導(dǎo)致了通過檢測(cè)ndm基因來判斷細(xì)菌對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦+氨曲南的敏感性的方法也不是十分準(zhǔn)確。依拉環(huán)素被認(rèn)為是治療cre和耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌的有效方法之一。隨著臨床廣泛使用，對(duì)依拉環(huán)素耐藥的細(xì)菌是不能忽視的威脅。但是除了表達(dá)tet(x)家族蛋白的細(xì)菌會(huì)對(duì)依拉環(huán)素耐藥以外，其他耐藥機(jī)制尚不清楚。

3、由于pcr和質(zhì)譜儀等方法的局限性，會(huì)導(dǎo)致現(xiàn)有方法無法檢測(cè)出全部耐藥表型，例如，某些kpc基因突變菌株，ndm型菌株，以及外排泵介導(dǎo)耐藥的菌株等會(huì)對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦，頭孢他啶/阿維巴坦+氨曲南，甚至是依拉環(huán)素耐藥。目前檢測(cè)耐碳青酶烯類腸桿菌科細(xì)菌對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦、頭孢他啶/阿維巴坦+氨曲南、依拉環(huán)素的敏感性主要是最小抑菌濃度(mics)，紙片擴(kuò)散法(k-b法)和e-test法。但是，傳統(tǒng)mics和k-b法需要12-24小時(shí)才能判讀結(jié)果，這會(huì)導(dǎo)致反饋給臨床藥敏結(jié)果的時(shí)間會(huì)推遲。盡管如此，實(shí)驗(yàn)室仍普遍采用這三種方法用于檢測(cè)耐碳青酶烯類腸桿菌科細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性，這是由于mics、k-b法和e-test法是保證結(jié)果準(zhǔn)確性的可靠方法。

4、因此，亟需一種耐碳青酶烯類腸桿菌科細(xì)菌敏感性檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)問題的不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種耐碳青酶烯類腸桿菌科細(xì)菌敏感性檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，采用該檢測(cè)試劑盒能快速且準(zhǔn)確地檢測(cè)耐碳青酶烯類腸桿菌科細(xì)菌對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦、頭孢他啶/阿維巴坦+氨曲南、依拉環(huán)素的敏感性。

2、為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明第一方面提供了一種耐碳青酶烯類腸桿菌科細(xì)菌敏感性檢測(cè)試劑盒，包括反應(yīng)液、藥敏檢測(cè)板、第一組抗生素、第二組抗生素、第三組抗生素，藥敏檢測(cè)板具有陽性孔、陰性孔、第一實(shí)驗(yàn)組孔、第二實(shí)驗(yàn)組孔、第三實(shí)驗(yàn)組孔；第一組抗生素以質(zhì)量呈梯度變化的方式包埋于第一實(shí)驗(yàn)組孔中，第一組抗生素為依拉環(huán)素；第二組抗生素以質(zhì)量呈梯度變化的方式包埋于第二實(shí)驗(yàn)組孔中，第二組抗生素為頭孢他啶，第二實(shí)驗(yàn)組孔中還包埋有阿維巴坦；第三組抗生素以質(zhì)量呈梯度變化的方式包埋于第三實(shí)驗(yàn)組孔中，第三組抗生素為頭孢他啶和氨曲南的組合，第三實(shí)驗(yàn)組孔中還包埋有阿維巴坦；反應(yīng)液包括蛋白胨、牛肉提取物、氯化鈉、葡萄糖、ph指示劑、滅菌水。

3、進(jìn)一步地，本發(fā)明將待檢測(cè)耐碳青酶烯類腸桿菌科細(xì)菌懸液和反應(yīng)液混合得到待檢測(cè)液，再將待檢測(cè)液分別加入第一實(shí)驗(yàn)組孔、第二實(shí)驗(yàn)組孔、第三實(shí)驗(yàn)組孔中，每一組抗生素皆包括敏感性折點(diǎn)濃度和耐藥性折點(diǎn)濃度，敏感性折點(diǎn)濃度為美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(clsi)和歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員(eucast)制定的該抗生素的敏感性折點(diǎn)，耐藥性折點(diǎn)濃度為美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(clsi)和歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)(eucast)制定的該抗生素的耐藥性折點(diǎn)。具體地，應(yīng)參考最新的clsi和eucast指南，以確保使用最準(zhǔn)確的折點(diǎn)數(shù)據(jù)。

4、進(jìn)一步地，根據(jù)2024版的clsi和eucast指南，本發(fā)明的第一組抗生素包括濃度為0.5mg/l的第一敏感性折點(diǎn)濃度、濃度為1mg/l的第二敏感性折點(diǎn)濃度及濃度為2mg/l的耐藥性折點(diǎn)濃度。具體地，對(duì)于第一組抗生素(依拉環(huán)素)，大腸埃希菌的敏感性折點(diǎn)為0.5mg/l；肺炎克雷伯菌的折點(diǎn)為1mg/l。

5、進(jìn)一步地，根據(jù)2024版的clsi和eucast指南，本發(fā)明的第二組抗生素包括濃度為8mg/l的敏感性折點(diǎn)濃度和濃度為16mg/l的耐藥性折點(diǎn)濃度。

6、進(jìn)一步地，根據(jù)2024版的clsi和eucast指南，本發(fā)明的第三組抗生素包括濃度為8mg/l的敏感性折點(diǎn)濃度和濃度為16mg/l的耐藥性折點(diǎn)濃度。

7、進(jìn)一步地，本發(fā)明的阿維巴坦的濃度為4mg/l。阿維巴坦本身并不是一種獨(dú)立的抗菌藥物，而是一種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，它通常與頭孢他啶抗生素聯(lián)合使用形成復(fù)方藥物頭孢他啶/阿維巴坦(簡(jiǎn)稱cza)，這種組合藥物旨在對(duì)抗一些產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的耐藥性細(xì)菌，這些細(xì)菌能夠分解并使β-內(nèi)酰胺類抗生素(如青霉素和頭孢菌素)失效。

8、進(jìn)一步地，以質(zhì)量份數(shù)計(jì)，本發(fā)明的反應(yīng)液包括10～15份蛋白胨、3～5份牛肉提取物、5～7份氯化鈉、10～15份葡萄糖、0.01份ph指示劑、1000份滅菌水。

9、進(jìn)一步地，以質(zhì)量份數(shù)計(jì)，本發(fā)明的反應(yīng)液包括10份蛋白胨、3份牛肉提取物、5份氯化鈉、10份葡萄糖、0.01份ph指示劑、1000份滅菌水。

10、進(jìn)一步地，本發(fā)明的ph指示劑選自甲基紅、紫色石蕊、溴百里酚藍(lán)、溴甲酚紫中的任一種。優(yōu)選地，ph指示劑選自溴甲酚紫。

11、進(jìn)一步地，本發(fā)明的耐碳青酶烯類腸桿菌科細(xì)菌敏感性檢測(cè)試劑盒還包括用于存儲(chǔ)反應(yīng)液的容器。

12、相應(yīng)地，本發(fā)明第二方面還提供了一種耐碳青酶烯類腸桿菌科細(xì)菌敏感性檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，步驟包括：

13、(1)將反應(yīng)液加入到陰性孔中；

14、(2)將反應(yīng)液和待檢測(cè)耐碳青酶烯類腸桿菌科細(xì)菌懸液混合得到待檢測(cè)液，再將待檢測(cè)液分別加入陽性孔、第一實(shí)驗(yàn)組孔、第二實(shí)驗(yàn)組孔、第三實(shí)驗(yàn)組孔中；

15、(3)將藥敏檢測(cè)板置于35～37℃下進(jìn)行培養(yǎng)4.0～4.5h，觀察各孔中顏色變化，判斷耐碳青酶烯類腸桿菌科細(xì)菌對(duì)每組抗生素的敏感性情況。

16、進(jìn)一步地，本發(fā)明的步驟(2)中待檢測(cè)液中耐碳青酶烯類腸桿菌科細(xì)菌的濃度為1.5×106cfu/ml。

17、本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)耐碳青酶烯類腸桿菌科細(xì)菌對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦、頭孢他啶/阿維巴坦+氨曲南、依拉環(huán)素敏感性的機(jī)理為：耐碳青酶烯類腸桿菌科細(xì)菌(cre)在生長(zhǎng)過程中分解葡萄糖產(chǎn)生酸性物質(zhì)，進(jìn)而引起反應(yīng)液ph值降低，這一變化可通過反應(yīng)液中的ph指示劑的顏色轉(zhuǎn)變來直觀展示。具體而言，當(dāng)cre對(duì)某一抗生素表現(xiàn)出耐藥性時(shí)，能夠在含有該抗生素的孔中正常增殖，其代謝活動(dòng)產(chǎn)生的酸性環(huán)境會(huì)使ph指示劑的顏色發(fā)生明顯變化。相反，如果cre對(duì)某一抗生素敏感，其生長(zhǎng)將被有效抑制，孔中的ph值及ph指示劑顏色將保持不變。

18、本發(fā)明的有益效果為：

19、(1)隨著對(duì)碳青霉烯類耐藥的細(xì)菌感染人數(shù)不斷增加，cza、cza+atm和erv的重要性日益凸顯，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒能快速檢測(cè)cre對(duì)cza、cza+atm和erv的敏感性，從而改善臨床結(jié)果并加快微生物診斷。

20、(2)本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒僅根據(jù)顏色變化即可判定試驗(yàn)結(jié)果，無需特殊的儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，使用方便。

21、(3)采用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒可以極大的縮短檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)只要確?？股貪舛鹊臏?zhǔn)確性，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒便能夠提供高度可靠的檢測(cè)結(jié)果，這為臨床正確選擇抗菌藥物預(yù)防和治療爭(zhēng)取了寶貴時(shí)間。