本發(fā)明屬于病原菌分離檢測，具體涉及一種抗副雞禽桿菌的單克隆抗體及其應用。

背景技術：

1、傳染性鼻炎(infection?coryza，ic)是由副雞禽桿菌引起的雞急性呼吸系統(tǒng)傳染病，與蛋雞產(chǎn)蛋量下降和生長緩慢有關。該在病臨床癥狀中一般表出現(xiàn)流鼻涕、面部腫脹、流淚、結(jié)膜炎等癥狀。該病和其他病原體混合感染后死亡率高，發(fā)病快且傳播迅速，對養(yǎng)雞業(yè)造成的經(jīng)濟損失大?；疾‰u群臨床癥狀通常為流淚，流鼻涕和一側(cè)或兩側(cè)眶下竇部位腫脹等。但因ic和雞霍亂以及禽痘等疾病發(fā)病癥狀相似，在沒有提前給雞群注射疫苗的情況下，養(yǎng)殖場出現(xiàn)和ic相似癥狀的病雞時，可能會無法立即判斷出病原菌。因此確診是否感染ic需要采樣病雞樣品，分離鑒定出病原菌，才能確定雞群感染的細菌。

2、直接檢測樣品中的副雞禽桿菌會受到多種機會細菌和其他成分的影響，對于樣品中副雞禽桿菌的檢測，需要先利用樣品前處理方法，去除中存在的干擾性物質(zhì)和難以忽略的背信號景干擾，以此提高后續(xù)檢測方法的靈敏度及特異性。此外，在進行檢測之前，需要將樣品中的目的菌進行濃縮富集，以達到檢測方法的檢測限。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法需要18-24h才能將目的菌的濃度培養(yǎng)到后續(xù)檢測方法的檢測限。免疫學檢測技術主要依賴于抗原抗體的特異性識別，通過已知抗體或抗原檢測未知抗原或抗體。其中，雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked?immunosorbent?assay，elisa)是基于免疫酶技術的一種免疫測定方法，通過將已知抗體連接在固相載體上，待測抗原與之結(jié)合再與檢測抗體、酶標二抗結(jié)合。可不需要特殊設備簡便地得到結(jié)果且具有快速、特異性強等優(yōu)點，適于大批量快速檢測，而基于該技術的快速檢測產(chǎn)品是臨床安全快速檢測分析研究的熱點。

技術實現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術中直接檢測食品中副雞禽桿菌時，前處理步驟復雜且難以獲得較高的靈敏度和特異性的缺陷，本發(fā)明提供了一種抗副雞禽桿菌的單克隆抗體及其應用。

2、本發(fā)明通過以下技術方案解決上述技術問題。

3、本發(fā)明的第一方面提供了一種抗副雞禽桿菌的單克隆抗體，其包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述輕鏈可變區(qū)包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，所述hcdr1的氨基酸序列如seq?id?no:9所示，所述hcdr2的氨基酸序列如seq?idno:10所示，所述hcdr3的氨基酸序列如seq?id?no:11所示，所述lcdr1的氨基酸序列如seqid?no:3所示，所述lcdr2的氨基酸序列如seq?id?no:4所示，所述lcdr3的氨基酸序列如seqid?no:5所示。

4、在本發(fā)明一實施方案中，所述輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)的框架區(qū)為鼠源框架區(qū)。

5、在本發(fā)明一實施方案中，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:6所示或與seq?id?no:6具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。

6、在本發(fā)明一實施方案中，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:12所示或與seq?id?no:12具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。

7、在本發(fā)明一實施方案中，所述單克隆抗體為全長抗體、fab、fab’、f(ab’)2或fv，所述fv優(yōu)選scfv。

8、在本發(fā)明一實施方案中，所述單克隆抗體為全長抗體。

9、在本發(fā)明一實施方案中，所述抗體的重鏈恒定區(qū)優(yōu)選源自鼠源重鏈igg2a恒定區(qū)或其變體，輕鏈恒定區(qū)優(yōu)選源自鼠源輕鏈κ鏈恒定區(qū)或其變體。

10、在本發(fā)明一實施方案中，所述單克隆抗體的輕鏈的氨基酸序列如seq?id?no:2所示；和/或，所述單克隆抗體的重鏈的氨基酸序列如seq?id?no:8所示。

11、本發(fā)明的第二方面提供了一種分離的核酸，所述分離的核酸編碼如本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體。

12、在本發(fā)明一實施方案中，編碼所述單克隆抗體的輕鏈的核苷酸序列如seq?id?no:1所示；和/或，編碼所述單克隆抗體的重鏈的核苷酸序列如seq?id?no:7所示。

13、本發(fā)明的第三方面提供了一種重組表達載體，所述重組表達載體包含如本發(fā)明第二方面所述的分離的核酸。

14、在本發(fā)明一實施方案中，所述重組表達載體為質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒載體，所述病毒載體優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體。

15、本發(fā)明的第四方面提供了一種轉(zhuǎn)化體，所述轉(zhuǎn)化體包含如本發(fā)明第二方面所述的分離的核酸或如本發(fā)明第三方面所述的重組表達載體，所述轉(zhuǎn)化體的宿主細胞為原核細胞或真核細胞。

16、在本發(fā)明一實施方案中，所述真核細胞為酵母細胞或哺乳動物細胞。

17、在本發(fā)明一實施方案中，所述宿主細胞為大腸桿菌、畢赤酵母、cho細胞或hek293細胞。

18、本發(fā)明的第五方面提供了一種制備抗副雞禽桿菌的單克隆抗體的方法，所述方法包含以下步驟：

19、培養(yǎng)如本發(fā)明第四方面所述的轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得所述單克隆抗體。

20、本發(fā)明的第六方面提供了如本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體、如本發(fā)明第二方面所述的分離的核酸、如本發(fā)明第三方面所述的重組表達載體、如本發(fā)明第四方面所述的轉(zhuǎn)化體在制備富集、分離和/或檢測副雞禽桿菌的試劑盒中的應用。

21、在本發(fā)明一實施方案中，所述試劑盒包括所述單克隆抗體；和/或，所述副雞禽桿菌選自血清型a副雞禽桿菌、血清型b副雞禽桿菌和血清型c副雞禽桿菌中的一種或多種。

22、在本發(fā)明一實施方案中，所述試劑盒還包括基于elisa或免疫磁珠技術用于富集、分離和/或檢測副雞禽桿菌的其他試劑。

23、在本發(fā)明一實施方案中，所述elisa為雙抗體夾心elisa或間接elisa，優(yōu)選為雙抗體夾心elisa。

24、本發(fā)明的第七方面提供了一種試劑盒，所述試劑盒包括如本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體。

25、在本發(fā)明一實施方案中，所述試劑盒還包括基于elisa或免疫磁珠技術用于富集、分離和/或檢測副雞禽桿菌的其他試劑。

26、在本發(fā)明一實施方案中，所述elisa為雙抗體夾心elisa或間接elisa，優(yōu)選為雙抗體夾心elisa。

27、本發(fā)明的第八方面提供了一種富集、分離和/或檢測副雞禽桿菌的方法，所述方法包括使用如本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體或如本發(fā)明第七方面所述的試劑盒與待測樣品接觸，對所述待測樣品中的副雞禽桿菌進行分離、富集和/或檢測。

28、在本發(fā)明一實施方案中，所述方法為基于elisa的方法；和/或，所述方法為非診斷目的的。

29、在本發(fā)明一實施方案中，所述elisa為雙抗體夾心elisa或間接elisa，優(yōu)選為雙抗體夾心elisa。

30、在本發(fā)明一實施方案中，所述雙抗體夾心elisa選自以下條件中的一種或多種：

31、(1)所述雙抗體夾心elisa所采用的捕獲抗體為所述單克隆抗體，和/或所述雙抗體夾心elisa所采用的檢測抗體為采用一種或多種副雞禽桿菌免疫兔子獲得的抗體；所述副雞禽桿菌優(yōu)選選自血清型a副雞禽桿菌、血清型b副雞禽桿菌和血清型c副雞禽桿菌中的一種或多種；

32、(2)所述捕獲抗體和檢測抗體的質(zhì)量比為(2-5):1，優(yōu)選為(2-3):1；

33、(3)所述方法檢測陽性的判定標準為：當樣本od450值≥平均值+3×標準差時，判定為陽性。

34、在符合本領域常識的基礎上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。

35、本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

36、本發(fā)明的積極進步效果在于：

37、本發(fā)明提供的單克隆抗體能夠特異性靶向副雞禽桿菌，親和力高，可用于副雞禽桿菌的富集、分離和/或檢測；基于該單克隆抗體構(gòu)建的檢測方法操作簡單快捷，特異性強，適于大批量樣品的快速檢測。