本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)食源性細(xì)菌領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)水產(chǎn)品中食源性致病菌的四重taqman?qpcr試劑。

背景技術(shù)：

1、近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外食品安全狀況不佳，因致病菌污染而導(dǎo)致的食物中毒事件頻頻出現(xiàn)。食源性致病菌已成為影響食品安全的最主要因素之一。隨著漁業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及食品加工技術(shù)的進(jìn)步，我國(guó)水產(chǎn)品供應(yīng)日益豐富，消費(fèi)也不斷增長(zhǎng)。然而，水產(chǎn)品在養(yǎng)殖、捕撈、儲(chǔ)藏、加工、運(yùn)輸、銷售等環(huán)節(jié)極易受到病原微生物污染，且我國(guó)各地居民普遍有吃鮮活水產(chǎn)品如生魚(yú)片、生蠔、生蝦的習(xí)慣。因此，檢測(cè)水產(chǎn)品及其加工品中的食源性致病菌是確保其食用安全的重要舉措，這直接關(guān)系到消費(fèi)者的健康和生命安全。根據(jù)現(xiàn)行國(guó)家食品安全監(jiān)管體系，金黃色葡萄球菌(staphylococcus?aureus，sau)、副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus，vp)、創(chuàng)傷弧菌(vibrio?vulnificus，vv)和志賀氏菌(shigellacastellani，sc)均屬于水產(chǎn)品中重點(diǎn)關(guān)注的食源性致病菌；這4種病原菌對(duì)食物污染引起的中毒事件常表現(xiàn)為急性腸胃炎，并伴有惡心、頭痛、低熱等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可造成死亡。因此，建立針對(duì)水產(chǎn)品及其加工制品中副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌4種食源性致病菌的快速檢測(cè)方法，對(duì)于保障我國(guó)水產(chǎn)品食用安全具有重要意義。

2、食源性致病菌傳統(tǒng)的基于選擇性培養(yǎng)基和生化分析的鑒定方法存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作繁瑣、檢測(cè)單一等缺陷，很難滿足現(xiàn)代化食品安全快速檢測(cè)的需要。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase?chain?reaction，pcr)，因具有高效、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)。其中，相較于常規(guī)pcr，實(shí)時(shí)熒光定量pcr(real-time?quantitative?pcr,qpcr)，尤其是多重qpcr，因其更為簡(jiǎn)化的流程、實(shí)時(shí)的樣本定量分析、無(wú)需更多步驟的樣品轉(zhuǎn)移和擴(kuò)增條帶可視化、更優(yōu)異的特異性和靈敏度及多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)等顯著性優(yōu)勢(shì)獲得了更為廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。至今，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道了不少分別針對(duì)這4種病原菌，或者將其中幾種與其它常見(jiàn)食源性致病菌(如大腸桿菌、單增李斯特菌等)一齊進(jìn)行檢測(cè)的qpcr試劑盒和檢測(cè)方法，例如，蔡先全發(fā)明的多重qpcr試劑盒靶向檢測(cè)副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌三種致病菌；何培彥發(fā)明的五重qpcr試劑盒靶向檢測(cè)金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌和志賀氏菌；上海測(cè)博生物發(fā)明的七重qpcr試劑盒靶向沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌和蠟樣芽胞桿菌，但未見(jiàn)研究和產(chǎn)品致力于水產(chǎn)品中副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌這4種重要食源性病原菌的同時(shí)檢測(cè)。因而，從應(yīng)用角度來(lái)看，開(kāi)發(fā)快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)的四重qpcr診斷方法以實(shí)現(xiàn)副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌及金黃色葡萄球菌的同時(shí)鑒定及檢測(cè)具有重要意義。

3、該四重qpcr檢測(cè)方法可以同時(shí)在水產(chǎn)品中檢測(cè)副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌(屬)和金黃色葡萄球菌四種病原，但考慮到四重qpcr需要在一個(gè)體系中加入四對(duì)引物及四條探針，為了保證引物和探針間互不影響，引物及探針需要高度的特異性，避免引物、探針間發(fā)生結(jié)合或產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。此外，考慮到模板中核酸的情況更為復(fù)雜，且不同引物所要求的退火溫度可能不同。因此，建立一種四重taqman探針?lè)╭pcr檢測(cè)方法具有很高的研究和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，但實(shí)現(xiàn)起來(lái)頗具難度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的至少一個(gè)不足，提供一種用于檢測(cè)水產(chǎn)品中食源性致病菌的四重taqman?qpcr試劑。

2、本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

3、第一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)水產(chǎn)品中食源性致病菌的四重taqmanqpcr試劑，所述食源性致病菌為副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌；所述試劑包括四種食源性致病菌對(duì)應(yīng)的特異性引物和taqman探針；

4、所述用于檢測(cè)副溶血性弧菌的引物序列及taqman探針序列為：上游引物vp-f、下游引物vp-r、taqman探針vp-p；

5、所述vp-f具有如seq?id?no.1所示的序列；

6、所述vp-r具有如seq?id?no.2所示的序列；

7、所述vp-p具有如seq?id?no.3所示的序列；

8、所述用于檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的引物序列及taqman探針序列為：上游引物vv-f、下游引物vv-r、taqman探針vv-p；

9、所述vv-f具有如seq?id?no.4所示的序列；

10、所述vv-r具有如seq?id?no.5所示的序列；

11、所述vv-p具有如seq?id?no.6所示的序列；

12、所述用于檢測(cè)志賀氏菌的引物序列及taqman探針序列為：上游引物sc-f、下游引物sc-r、taqman探針sc-p；

13、所述sc-f具有如seq?id?no.7所示的序列；

14、所述sc-r具有如seq?id?no.8所示的序列；

15、所述sc-p具有如seq?id?no.9所示的序列；

16、所述用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的引物序列及taqman探針序列為：上游引物sau-f、下游引物sau-r、taqman探針sau-p、上游引物sau-f1、下游引物sau-r1、taqman探針sau-p1；

17、所述sau-f具有如seq?id?no.10所示的序列；

18、所述sau-r具有如seq?id?no.11所示的序列；

19、所述sau-p具有如seq?id?no.12所示的序列；

20、所述sau-f1具有如seq?id?no.13所示的序列；

21、所述sau-r1具有如seq?id?no.14所示的序列；

22、所述sau-p1具有如seq?id?no.15所示的序列。

23、在一些實(shí)例中，不同菌株的探針標(biāo)記有不同的熒光-淬滅基團(tuán)。

24、在一些實(shí)例中，所述探針vp-p的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告染料為fam，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)為bhq1；

25、所述探針vv-p的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告染料為cy5，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)為bhq2；

26、所述探針sc-p的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告染料為vic，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)為bhq1；

27、所述探針sau-p的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告染料為rox，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)為bhq2。

28、第二個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)水產(chǎn)品中食源性致病菌的四重taqmanqpcr試劑盒，所述四重taqman?qpcr試劑盒包含第一個(gè)方面所述的四重taqman?qpcr檢測(cè)試劑。

29、在一些實(shí)例中，所述食源性致病菌為副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌。

30、在一些實(shí)例中，所述試劑盒還包括陰性對(duì)照品，陽(yáng)性對(duì)照品和裂解液。

31、在一些實(shí)例中，所述陽(yáng)性對(duì)照品為副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌對(duì)應(yīng)的基因組dna混合物。

32、在一些實(shí)例中，所述陰性對(duì)照品為depc水。

33、在一些實(shí)例中，所述裂解液組成為4.9～5.1mmol/l三(羥甲基氨基甲烷)和0.019～0.121％的十二烷基硫酸鈉溶液。

34、第三個(gè)方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)水產(chǎn)品中副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的四重taqman?qpcr檢測(cè)試劑的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

35、1)提待測(cè)樣本的基因組dna備用；

36、2)將待測(cè)樣本的基因組dna作為模板加入到四重qpcr反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括第二個(gè)方面所述的四重taqman?qpcr試劑盒；

37、3)設(shè)定qpcr程序并收集擴(kuò)增過(guò)程中的熒光信號(hào)，并進(jìn)行結(jié)果判定。

38、本發(fā)明的有益效果是：

39、1.由于目前缺乏行之有效的同時(shí)檢測(cè)水產(chǎn)品中食源性致病菌的方法，本發(fā)明根據(jù)水產(chǎn)品重要食源性致病菌的特點(diǎn)，結(jié)合多重qpcr技術(shù)，設(shè)計(jì)了多重qpcr檢測(cè)水產(chǎn)品中四種食源性致病菌的引物和探針組，包括副溶血性弧菌上下游引物及探針、創(chuàng)傷弧菌上下游引物及探針、志賀氏菌上下游引物及探針和金黃色葡萄球菌上下游引物及探針，分別對(duì)應(yīng)于序列表中seq?id?no?1、2和3、seq?id?no?4、5和6、seq?id?no?7、8和9及seq?id?no?10、11和12。這種多重檢測(cè)方式提高了檢測(cè)效率，減少了實(shí)驗(yàn)成本。

40、2.本發(fā)明提供的靶向副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的引物-探針組合具有極高的特異性，僅在待測(cè)樣本中含有目標(biāo)菌時(shí)，才可在對(duì)應(yīng)的熒光檢測(cè)通道中觀測(cè)到熒光信號(hào)，有效避免了假陽(yáng)性或假陰性事件的發(fā)生，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

41、3.本發(fā)明建立的四重taqman探針?lè)╭pcr檢測(cè)方法具有較高的靈敏度，針對(duì)副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測(cè)靈敏度均可達(dá)到2.0×102cfu/ml，且結(jié)果具有極佳的可重復(fù)性。此外，相較于傳統(tǒng)的依托于純培養(yǎng)物的生化鑒定，本檢測(cè)方法能夠在8～11h內(nèi)完成樣本檢測(cè)的全過(guò)程(包括樣品的預(yù)增菌過(guò)程)，其中qpcr反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為1h，人工操作時(shí)間1h。

42、4.綜上所述，本發(fā)明提供了一種四重taqman?qpcr試劑盒及其檢測(cè)方法，該試劑盒具有高效、準(zhǔn)確、靈敏、快速等特點(diǎn)，為水產(chǎn)品及其加工制品質(zhì)量安全檢測(cè)工作中對(duì)上述4種食源性致病菌的檢測(cè)提供一種準(zhǔn)確快速、高效經(jīng)濟(jì)的手段，對(duì)保障我國(guó)水產(chǎn)品食用安全具有重要意義。