本發(fā)明屬于生物，更具體地，涉及一種用于檢測(cè)膠質(zhì)細(xì)胞瘤基因的引物探針組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤簡(jiǎn)稱膠質(zhì)瘤，也稱為膠質(zhì)細(xì)胞瘤，是神經(jīng)系統(tǒng)的頭號(hào)腫瘤，約占顱腦腫瘤的40％～50％。根據(jù)非典型性、核分裂指數(shù)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖和壞死程度等特征，who將膠質(zhì)瘤分為四級(jí)；其中，i級(jí)以良性毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤為主，占膠質(zhì)瘤的5％左右，通常可以治愈；ii級(jí)為一般的星形細(xì)胞瘤或混合性少突星形細(xì)胞瘤，占膠質(zhì)瘤的30％～40％左右；iii級(jí)為間變型星形細(xì)胞瘤，占膠質(zhì)瘤的15％～25％左右，一般由i級(jí)演變而來(lái)；iv級(jí)為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，占膠質(zhì)瘤的1/3左右。

2、研究表明，在2-3級(jí)膠質(zhì)瘤中，約80％具有異檸檬酸脫氫酶(idh)突變特征，異檸檬酸脫氫酶(idh)基因突變是膠質(zhì)瘤發(fā)病早期的重要事件，可用于判斷膠質(zhì)瘤手術(shù)切除范圍和患者的預(yù)后。異檸檬酸脫氫酶1(idh1)突變常見(jiàn)于2級(jí)或3級(jí)膠質(zhì)瘤以及繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中。大多數(shù)idh突變發(fā)生在idh1精氨酸132(r132)殘基或idh2精氨酸172(r172)殘基上。

3、研究表明，在人類膠質(zhì)瘤中，除了idh突變特征之外，還有一些重要的分子突變特征，如h3、braf基因位點(diǎn)以及tert?promoter區(qū)等，不同的分子突變特征對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與治療的影響不同。因此針對(duì)不同位點(diǎn)的不同突變進(jìn)行精細(xì)的檢測(cè)，在臨床實(shí)踐中具有重要的意義。

4、目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)膠質(zhì)細(xì)胞瘤基因突變常用的方法包括免疫組化，sanger測(cè)序，焦磷酸測(cè)序，二代測(cè)序等，這些方法要么成本高檢測(cè)周期長(zhǎng)，要么檢測(cè)通量低，或者靈敏度低，操作復(fù)雜。

5、檢測(cè)突變基因的同時(shí)，如何實(shí)現(xiàn)對(duì)野生型基因的完全抑制，且不影響突變型基因的擴(kuò)增，也是膠質(zhì)細(xì)胞瘤基因檢測(cè)的難點(diǎn)。

6、因此市場(chǎng)急需一款高通量，高靈敏度，特異性高，同時(shí)實(shí)現(xiàn)完全抑制野生型基因擴(kuò)增的膠質(zhì)細(xì)胞瘤檢測(cè)產(chǎn)品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于檢測(cè)膠質(zhì)細(xì)胞瘤基因的引物探針組合物，所述引物探針組合物包括第1組引物探針組合物；所述第1組引物探針組合物包括上游引物idh2-r172k-f、tert-c228t-f、tert-c250t-f、h3c2-k28m-f，下游引物idh2-r172k-r、tert-r、h3c2-k28m-r，探針idh2-r172k-p、tert-p、h3c2-k28m-p；上游引物核苷酸序列分別如seq?id?no.1～4所示，其中上游引物3’末端第1位堿基與靶基因互補(bǔ)，第2～6位堿基包含1～3個(gè)與靶基因錯(cuò)配的堿基，其余堿基與靶基因完全互補(bǔ)；下游引物核苷酸序列分別如seq?id?no.5～7所示；探針核苷酸序列分別如seq?id?no.8～10所示，探針序列由不同的熒光基團(tuán)修飾。

2、第1組引物探針組合物的靶向膠質(zhì)細(xì)胞瘤基因見(jiàn)下表。

3、表1第1組和第2組引物探針組合物對(duì)應(yīng)的基因

4、

5、作為優(yōu)選方案，所述引物探針組合物還包括第2組引物探針組合物；所述第2組引物探針組合物包括上游引物idh1-r132h-f、braf-v600e-f、h3f3a-k28m-f、h3f3a-g35r-f、h3f3a-g35v-f，下游引物idh1-r132h-r、braf-v600e-r、h3f3a-r，探針idh1-r132h-p、braf-v600e-p、h3f3a-p；上游引物核苷酸序列分別如seq?id?no.11～15所示，其中上游引物3’末端第1位堿基與靶基因互補(bǔ)，第2～6位堿基包含1～3個(gè)與靶基因錯(cuò)配的堿基，其余堿基與靶基因完全互補(bǔ)；下游引物核苷酸序列分別如seq?id?no.16～18所示；探針核苷酸序列分別如seq?id?no.19～21所示，探針序列由不同的熒光基團(tuán)修飾。

6、第2組引物探針組合物的靶向膠質(zhì)細(xì)胞瘤基因見(jiàn)表1。

7、作為優(yōu)選方案，所述引物探針組合物還包括第3組引物探針組合物；所述第3組引物探針組合物包括上游引物egfr-f1、egfr-f2、egfr-f3、egfr-f4、met-f1、met-f2、met-f3、met-f4、met-f5、met-f6，下游引物egfr-r1、met-r1、egfr-r2、met-r2、met-r3，探針egfr-p1、egfr-p2、egfr-p3、met-p1、met-p2、met-p3；上游引物核苷酸序列分別如seq?id?no.22～31所示；下游引物核苷酸序列分別如seq?id?no.32～36所示；探針核苷酸序列分別如seqid?no.37～42所示，探針序列由不同的熒光基團(tuán)修飾。

8、第3組引物探針組合物的靶向膠質(zhì)細(xì)胞瘤基因見(jiàn)下表。

9、表2第3組引物探針組合物對(duì)應(yīng)的基因

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12、作為優(yōu)選方案，所述引物探針組合物還包括內(nèi)參引物探針組合物。

13、作為優(yōu)選方案，所述第1組或第2組引物探針組合物的內(nèi)參引物探針組合物為gapdh-f、gapdh-r、gapdh-p，其序列分別如seq?id?no.43～45所示。

14、作為優(yōu)選方案，所述第3組引物探針組合物的內(nèi)參引物探針組合物為rnase?p-f、rnase?p-r、rnase?p-p，其序列分別如seq?id?no.46～48所示。

15、當(dāng)?shù)?組、第2組、第3組引物探針組合物組合時(shí)，通過(guò)一次檢測(cè)即可判斷樣本是否屬于上述8種基因突變或融合；當(dāng)樣本屬于上述8種基因中的一種或多種時(shí)，一次檢測(cè)即可對(duì)樣本定性。上述引物探組合物信息見(jiàn)下表，其中以小寫(xiě)字母表示的堿基為錯(cuò)配堿基。

16、表3引物探針組合物信息

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20、本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測(cè)膠質(zhì)細(xì)胞瘤基因的試劑盒，所述試劑盒包括擴(kuò)增反應(yīng)體系，擴(kuò)增反應(yīng)體系包括前述第1組至第3組引物探針組合物中一組或多組，不同組間分管設(shè)置。每組中的探針通過(guò)不同的熒光基團(tuán)修飾，從而識(shí)別基因。

21、作為優(yōu)選方案，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系還包括擴(kuò)增緩沖液、擴(kuò)增酶、擴(kuò)增增強(qiáng)緩沖液。

22、作為優(yōu)選方案，所述試劑盒還包括反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。試劑盒包括反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系時(shí)，可用于檢測(cè)rna。

23、作為優(yōu)選方案，所述試劑盒還包括質(zhì)控品。

24、作為優(yōu)選方案，所述質(zhì)控品包括陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品。

25、作為優(yōu)選方案，所述試劑盒還包括內(nèi)參。

26、本試劑盒在反應(yīng)液中同步加入了內(nèi)參探針(rox)，在陰性質(zhì)控品(nc)、無(wú)模板陰性對(duì)照(ntc)、陽(yáng)性質(zhì)控品(pc)均正常的前提下，可判斷對(duì)應(yīng)熒光通道下基因陰性或陽(yáng)性。

27、當(dāng)試劑盒包含第1組、第2組、第3組引物探針組合物時(shí)，通過(guò)一次檢測(cè)即可判斷樣本是否屬于上述8種基因；當(dāng)樣本屬于上述8種基因中的一種或多種時(shí)，一次檢測(cè)即可對(duì)樣本定性。

28、試劑盒適用于新鮮病理組織、石蠟包埋組織、石蠟切片組織或腦脊液樣本的基因檢測(cè)。

29、試劑盒組成信息見(jiàn)下表。

30、表4試劑盒組成

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33、本發(fā)明的第三方面，提供了前述引物探針組合物在檢測(cè)膠質(zhì)細(xì)胞瘤基因試劑盒中的應(yīng)用，包括以下應(yīng)用步驟：

34、s1：按照引物探針組合物組別，分別將引物探針組合物與擴(kuò)增緩沖液、擴(kuò)增酶、擴(kuò)增增強(qiáng)緩沖液、待測(cè)樣本混合制成擴(kuò)增反應(yīng)體系，將擴(kuò)增反應(yīng)體系分別加入不同的反應(yīng)孔；

35、s2：pcr擴(kuò)增并采集熒光信號(hào)，根據(jù)熒光信號(hào)，判斷樣本的基因的陰性陽(yáng)性。

36、作為優(yōu)選方案，待測(cè)樣本包括dna樣本和cdna樣本。cdna樣本由rna反轉(zhuǎn)錄而來(lái)。

37、作為優(yōu)選方案，dna樣本由新鮮病理組織、石蠟包埋組織、石蠟切片組織或腦脊液樣本提取而來(lái)。

38、作為優(yōu)選方案，cdna樣本制備方法包括如下步驟：

39、s11：提取樣本rna；

40、s12：將rna反轉(zhuǎn)錄成cdna。

41、作為優(yōu)選方案，每條引物在擴(kuò)增反應(yīng)體系溶液中的濃度為0.05～0.2μmol/l。

42、作為優(yōu)選方案，每條探針在擴(kuò)增反應(yīng)體系溶液中的濃度為0.03～0.1μmol/l。

43、通過(guò)以上述技術(shù)方案，本發(fā)明產(chǎn)生了以下有益效果：

44、(1)對(duì)dna突變檢測(cè)部分，通過(guò)設(shè)計(jì)使上游引物3’末端第1位堿基與靶基因互補(bǔ)，第2～6位堿基包含1～3個(gè)與靶基因錯(cuò)配的堿基，其余堿基與靶基因完全互補(bǔ)，控制等位基因的特異性延伸；由于引入錯(cuò)配堿基，導(dǎo)致pcr引物延伸速度變慢，當(dāng)錯(cuò)配達(dá)到一定程度時(shí)，引物延伸終止，得不到特異長(zhǎng)度的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，從而抑制野生型基因擴(kuò)增。

45、(2)本發(fā)明通過(guò)系統(tǒng)的篩選，提高了膠質(zhì)細(xì)胞瘤基因突變檢測(cè)引物的特異性和靈敏度，使基因突變低頻變異檢測(cè)性能(vaf)達(dá)到0.2％，基因融合達(dá)到30拷貝的檢出限。

46、(3)本發(fā)明的設(shè)計(jì)的引物涵蓋了8種膠質(zhì)細(xì)胞瘤基因，本發(fā)明通過(guò)多重引物篩選，確定了相互干擾程度最小的引物組合，繼而根據(jù)基因分型需要，進(jìn)行科學(xué)合理的引物分組設(shè)計(jì)；根據(jù)熒光pcr儀四種常用的熒光通道(fam、rox、vic、cy5)，利用不同的熒光基團(tuán)修飾探針，一次可同時(shí)檢測(cè)8種膠質(zhì)細(xì)胞瘤基因，基因覆蓋面廣，檢測(cè)通量高。