本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種在瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)中提取生物大分子的方法。

背景技術(shù)：

1、瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)和腫瘤學(xué)研究的重要技術(shù)。該實(shí)驗(yàn)通過在半固體瓊脂糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，模擬體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)的三維環(huán)境，使具有克隆形成能力的細(xì)胞能夠形成獨(dú)立的克隆。這種實(shí)驗(yàn)方法可以用于評(píng)估細(xì)胞的增殖能力、惡性轉(zhuǎn)化程度以及對(duì)藥物和其他治療手段的敏感性。

2、在瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)中，生物大分子如核酸(dna和rna)和蛋白質(zhì)起著至關(guān)重要的作用。這些生物大分子參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂、分化和凋亡等生命活動(dòng)過程，并且在克隆形成過程中可能發(fā)生特定的變化。例如，某些基因的表達(dá)水平可能會(huì)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的修飾狀態(tài)可能會(huì)影響細(xì)胞的克隆形成能力。因此，提取和分析瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)中的生物大分子對(duì)于深入了解克隆形成的機(jī)制以及開發(fā)新的治療策略具有重要意義。

3、然而，現(xiàn)有的rna/dna提取試劑盒無(wú)法溶解/去除包裹細(xì)胞的瓊脂糖，其僅能對(duì)非瓊脂糖包裹細(xì)胞進(jìn)行提取，將其直接用于提取瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)中的dna\rna時(shí)，其不僅提取效率差，而且還存在一定的樣本偏差。并且，目前常用的蛋白質(zhì)裂解液ripa等，也難以溶解瓊脂糖，將其直接用于提取瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)中的蛋白質(zhì)時(shí)，其不僅提取效率差，而且還存在一定的樣本偏差，同時(shí)，瓊脂糖在進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，也會(huì)有部分fbs，其容易造成提取蛋白的污染，對(duì)蛋白質(zhì)的定量產(chǎn)生一定干擾。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于此，本發(fā)明的目的在于提供一種在瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)中提取生物大分子的方法，所述方法具有提取效率高、操作簡(jiǎn)單、提取得到的核酸(dna和rna)和蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量好，完全滿足生物信息學(xué)的分析需求等優(yōu)點(diǎn)，采用所述方法，可以有效提取出瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)中的核酸(dna和rna)和蛋白質(zhì)進(jìn)行分子生物學(xué)分析，如pcr，q-rt-pcr,western-blot分析。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種在瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)中提取rna的方法，所述方法包括如下：

4、(1)采用ctac提取液溶解瓊脂糖細(xì)胞混合物。優(yōu)選地，所述ctac提取液的配置方法包括如下：將2％w/v?ctac,2％w/v?pvp-40,2m氯化鈉,100mm?tris-hcl(ph?8.0),和20mmedta混合于rnase-free水中，經(jīng)過高溫高壓處理后溶解制成ctac提取液，放于室溫下備用。優(yōu)選地，ctac提取液溶解瓊脂糖細(xì)胞混合物的方法為：在65℃黑暗環(huán)境中預(yù)熱ctac提取液，加入2％v/vβ-巰基乙醇混合均勻,按照1：5體積加入到去除瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)的上層培養(yǎng)液后的瓊脂糖細(xì)胞混合物中溶解瓊脂糖細(xì)胞混合物。

5、(2)加入氯仿提取。優(yōu)選地，具體提取方法為：混合均勻后的液體按照1：1體積加入氯仿再次混合，重復(fù)該操作1次。

6、(3)提取液加入異丙醇純化沉淀得到核酸沉淀物。優(yōu)選地，具體純化沉淀方法為：用15,000g的速度在室溫下離心5分鐘后，將上清液按照1：1體積與異丙醇混合，再次用15,000g的速度在室溫下離心15分鐘后，在室溫下移除上清液，將核酸沉淀物用70％酒精清洗兩次后風(fēng)干。

7、(4)rna分離和純化獲得rna樣品：在干燥后的核酸沉淀物中加入rnase-free水，再加入dnase?i酶，控溫消化dna雜質(zhì)，用rna提取試劑盒favorpreptmtissue?total?rna?minikit提取rna，在rna沉淀-水混合懸液加入farb?buffer和β-巰基乙醇，震蕩混勻直到rna沉淀物溶解；再加入rnase-free酒精混合均勻，混合液經(jīng)過farb?mini?column過濾，使用washbuffer?2清洗，加入rnase-free水在farb?mini?column膜上洗提rna，得到rna樣品用于qpcr實(shí)驗(yàn)分析。優(yōu)選地，具體方法為：在干燥后的核酸沉淀物中加入50ul的rnase-free水，再加入1ul?dnase?i酶，在37℃下消化dna雜質(zhì)30分鐘，接著，用rna提取試劑盒favorpreptmtissue?total?rna?mini?kit提取rna，在每50μl?of?rna沉淀-水混合懸液加入350μl?of?farb?buffer和3.5μlβ-巰基乙醇，震蕩混勻直到rna沉淀物溶解，再加入同等體積的70％rnase-free酒精混合均勻，混合液經(jīng)過farb?mini?column過濾，使用750μl?ofwash?buffer?2清洗4次后，加入40～100μl?of?rnase-free水在farb?mini?column膜上洗提rna，得到rna樣品用于rna分析。

8、本發(fā)明提供了一種在瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)中提取dna的方法，所述方法包括如下：

9、(1)采用ctac提取液溶解瓊脂糖細(xì)胞混合物。優(yōu)選地，所述ctac提取液的配置方法包括如下：將2％w/v?ctac,2％w/v?pvp-40,2m氯化鈉,100mm?tris-hcl(ph?8.0),和20mmedta混合于rnase-free水中，經(jīng)過高溫高壓處理后溶解制成ctac提取液，放于室溫下備用。優(yōu)選地，ctac提取液溶解瓊脂糖細(xì)胞混合物的方法為：在65℃黑暗環(huán)境中預(yù)熱ctac提取液，加入2％v/vβ-巰基乙醇混合均勻,按照1：5體積加入到去除瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)的上層培養(yǎng)液后的瓊脂糖細(xì)胞混合物中溶解瓊脂糖細(xì)胞混合物。

10、(2)加入氯仿提取。優(yōu)選地，具體提取方法為：混合均勻后的液體按照1：1體積加入氯仿再次混合，重復(fù)該操作1次。

11、(3)提取液加入異丙醇純化沉淀得到核酸沉淀物。優(yōu)選地，具體純化沉淀方法為：用15,000g的速度在室溫下離心5分鐘后，將上清液按照1：1體積與異丙醇混合，再次用15,000g的速度在室溫下離心15分鐘后，在室溫下移除上清液，將核酸沉淀物用70％酒精清洗兩次后風(fēng)干。

12、(4)dna分離和純化得到dna樣品：在干燥后的核酸沉淀物中加入rnase-free水，再加入rnase?a，控溫消化rna雜質(zhì)，用theblood?and?tissue?kit提取gdna，用于pcr實(shí)驗(yàn)分析。優(yōu)選地，dna分離和純化的具體方法為：在干燥后的核酸沉淀物中加入50ul的rnase-free水，再加入1ul?rnase?a，在37℃下消化rna雜質(zhì)30分鐘，用thebloodand?tissue?kit提取gdna，得到gdna樣品，用于后續(xù)dna分析。

13、本發(fā)明還提供了一種在瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)中提取蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括如下：

14、(1)pbs清洗瓊脂糖細(xì)胞混合物。優(yōu)選地，具體方法為：1個(gè)24孔板加入2ml的pbs，將去除瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)的上層培養(yǎng)液后的瓊脂糖細(xì)胞混合物與pbs混合均勻。集中3個(gè)24孔板pbs-瓊脂糖細(xì)胞混合物，移入15ml離心管方法，加入大約13ml?pbs，700g離心2分鐘。移除上層10ml清夜，再加入10ml?pbs進(jìn)行二次清洗后，移除13ml上清液，將清洗后的瓊脂糖細(xì)胞混合物用液氮速凍。

15、(2)ripa裂解液溶解。優(yōu)選地，具體方法為：將500μl?ripa裂解液+蛋白酶抑制劑+磷酸酶抑制劑+2％β-巰基乙醇加入到每1ml瓊脂糖細(xì)胞混合物，然后將其在≥95℃下加熱10分鐘。

16、(3)離心冷卻分離。優(yōu)選地，具體方法為：在冰上冷卻1h，待瓊脂糖細(xì)胞混合物半凝固后，在4℃離心機(jī)中以最高速離心30分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新的ep管中，加入1：1體積100％甲醇和1/5體積的氯仿，混合均勻，離心15，000g，5分鐘。去除上清液，保留白色分離層。

17、(4)甲醇純化沉淀蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，具體方法為：加入1：1體積100％甲醇，混合均勻，離心15,000g，5分鐘，移除上清液，保留白色沉淀eb。

18、(5)蛋白質(zhì)重新溶解。優(yōu)選地，具體方法為：風(fēng)干后再用適量ripa裂解液重新溶解蛋白沉淀，得到蛋白質(zhì)樣品供蛋白質(zhì)分析。

19、本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明所述方法可以有效提取出瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)中的核酸(dna和rna)和蛋白質(zhì)進(jìn)行分子生物學(xué)分析，如pcr，q-rt-pcr,western-blot分析，具有效率高、操作簡(jiǎn)單、提取得到的核酸(dna和rna)和蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量好，完全滿足生物信息學(xué)的分析需求等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所述方法采用ctac提取液對(duì)包裹細(xì)胞的瓊脂糖進(jìn)行溶解，然后采用氯仿提取、異丙醇純化沉淀的方式進(jìn)行核酸沉淀，然后再對(duì)核酸沉淀進(jìn)行dna/rna分離純化，其不僅提取效率高，而且有效避免了樣本偏差，其得到的dna/rna樣品能完全滿足后續(xù)的生物信息學(xué)分析。本發(fā)明所述方法采用pbs對(duì)瓊脂糖包裹的細(xì)胞進(jìn)行洗滌溶解，雖會(huì)損失一定的蛋白樣本，但能夠有效降低fbs污染，最后通過甲醇對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)一步濃縮，得到的蛋白質(zhì)樣品完全滿足蛋白質(zhì)分析的需求。