本發(fā)明涉及藥物生物，具體涉及高癸酸耐受性的達(dá)托霉素高產(chǎn)工程菌株及其構(gòu)建和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、達(dá)托霉素是治療耐藥革蘭氏陽性菌感染的新型脂肽類抗生素，于2003年首次被美國fda批準(zhǔn)上市，由cubist公司生產(chǎn)，主治多重耐藥菌的重癥感染，具有廣譜的抗革蘭氏陽性菌活性，在臨床上應(yīng)用非常廣泛。

2、脂肽類抗生素在工業(yè)上通常使用微生物發(fā)酵純化獲取。脂肪酸前體(如癸酸)是脂肽類抗生素的起始生物合成元件，最終形成脂肽類抗生素的具有高度生物活性的脂肪酸尾鏈。因此，脂肪酸前體對于脂肽類抗生素的生物合成及其藥物活性的發(fā)揮都至關(guān)重要。但脂肪酸前體的高毒性和低利用率限制了脂肽類抗生素高產(chǎn)策略的開發(fā)。達(dá)托霉素作為脂肽類抗生素家族重要成員，其工業(yè)生產(chǎn)也受限于生物合成直接前體癸酸的高細(xì)胞毒性和低利用率，一直很難通過提高直接前體濃度來提高產(chǎn)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)中達(dá)托霉素的生產(chǎn)菌種對脂肪酸前體低耐受性的不足，本發(fā)明提供了一株高癸酸耐受性的達(dá)托霉素高產(chǎn)工程菌株及其構(gòu)建和應(yīng)用。本發(fā)明通過改造達(dá)托霉素生物合成起始蛋白(dpte蛋白)并結(jié)合敲除負(fù)調(diào)控因子tagr編碼基因，改善了工程菌株的癸酸前體利用率，顯著提高了工程菌株的達(dá)托霉素產(chǎn)量，且具有更佳的癸酸耐受性。

2、本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

3、(一)一種dpte突變蛋白

4、所述dpte突變蛋白包括dpte突變蛋白dpte::k454i、dpte突變蛋白dpte::k454r和dpte突變蛋白dpte::k454i::q420n::k184q中的一種。

5、其中，所述dpte突變蛋白dpte::k454i是由dpte蛋白的第454位賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岫?；所述dpte突變蛋白dpte::k454r是由dpte蛋白的第454位賴氨酸突變?yōu)榫彼岫茫凰鰀pte突變蛋白dpte::k454i::q420n::k184q是由dpte蛋白的第454位賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?、?20位谷氨酰胺突變?yōu)樘於０芬约暗?84位賴氨酸突變?yōu)楣劝滨０范谩?/p>

6、其中，所述dpte蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示；所述dpte突變蛋白dpte::k454i的氨基酸序列如seq?id?no.4所示；所述dpte突變蛋白dpte::k454r的氨基酸序列如seq?id?no.6所示；所述dpte突變蛋白dpte::k454i::q420n::k184q的氨基酸序列如seq?idno.8所示。

7、(二)一種用于編碼dpte突變蛋白的dpte突變蛋白編碼基因

8、所述dpte突變蛋白編碼基因包括dpte突變蛋白編碼基因k454i、dpte突變蛋白編碼基因k454r、dpte突變蛋白編碼基因k454i::q420n::k184q中的一種。

9、其中，所述dpte突變蛋白編碼基因k454i用于編碼所述dpte突變蛋白dpte::k454i，堿基序列如seq?id?no.3所示；所述dpte突變蛋白編碼基因k454r用于編碼所述dpte突變蛋白dpte::k454r，堿基序列如seq?id?no.5所示；所述dpte突變蛋白編碼基因k454i::q420n::k184q用于編碼所述dpte突變蛋白dpte::k454i::q420n::k184q，堿基序列如seqid?no.7所示。

10、(三)一種工程菌株

11、所述工程菌株以玫瑰孢鏈霉菌(streptomycesroseosporus)，保藏編號為cgmcc4.7231為出發(fā)菌株，所述工程菌株是將出發(fā)菌株中的dpte蛋白編碼基因替換為上述dpte突變蛋白編碼基因，并敲除菌體負(fù)調(diào)控因子tagr蛋白編碼基因而得。

12、其中，所述dpte蛋白編碼基因的堿基序列如seq?id?no.1所示。

13、所述tagr蛋白編碼基因的堿基序列如seq?id?no.9所示。所述tagr蛋白編碼基因表達(dá)tagr蛋白，所述tagr蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.10所示，所述tagr蛋白為磷壁酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)負(fù)調(diào)控因子。

14、優(yōu)選地，所述工程菌株(streptomyces?roseosporus)delta-tagr::dpte3m是通過將出發(fā)菌株中的dpte蛋白編碼基因替換為dpte突變蛋白編碼基因k454i::q420n::k184q，并敲除tagr蛋白編碼基因后構(gòu)建的。本發(fā)明通過此優(yōu)選方案構(gòu)建了工程菌株：玫瑰孢鏈霉菌(streptomyces?roseosporus)delta-tagr::dpte3m。所述工程菌株的分類命名為玫瑰孢鏈霉菌(streptomyces?roseosporus)delta-tagr::dpte3m，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為cgmccno.31146，保藏日為2024年7月2日。

15、(四)一種工程菌株的構(gòu)建方法

16、所述構(gòu)建方法包括以下步驟：

17、s1)以玫瑰孢鏈霉菌的基因組為模板，擴(kuò)增獲得dpte蛋白編碼基因的上游同源臂和下游同源臂并將dpte蛋白編碼基因的上游同源臂和下游同源臂構(gòu)建至敲除載體pkc1139，得到dpte基因敲除質(zhì)粒pkc1139-dpte-knock-out；

18、使用大腸桿菌e.coil?et12567/puz8002介導(dǎo)的大腸桿菌-鏈霉菌種間接合轉(zhuǎn)移技術(shù)，將dpte基因敲除質(zhì)粒pkc1139-dpte-knock-out導(dǎo)入野生型的玫瑰孢鏈霉菌中，獲得dpte缺失型玫瑰孢鏈霉菌δdpte。

19、s2)以玫瑰孢鏈霉菌的基因組為模板，擴(kuò)增獲得dpte蛋白編碼基因片段，以dpte蛋白編碼基因片段為模板，使用pcr技術(shù)引入氨基酸突變，得到dpte突變蛋白編碼基因片段，將dpte突變蛋白編碼基因片段插入表達(dá)載體pset152，得到dpte突變質(zhì)粒；

20、使用大腸桿菌e.coil?et12567/puz8002介導(dǎo)的大腸桿菌-鏈霉菌種間接合轉(zhuǎn)移技術(shù)，將dpte突變質(zhì)粒導(dǎo)入dpte缺失型玫瑰孢鏈霉菌δdpte中，獲得dpte突變型玫瑰孢鏈霉菌；

21、所述步驟s2)中，所述dpte蛋白編碼基因片段的堿基序列如seq?id?no.1所示；所述dpte突變蛋白編碼基因片段的堿基序列如seq?id?no.3、seq?id?no.5或seq?id?no.7所示。

22、s3)以玫瑰孢鏈霉菌的基因組為模板，擴(kuò)增獲得tagr蛋白編碼基因的上游同源臂和下游同源臂并將tagr蛋白編碼基因的上游同源臂和下游同源臂構(gòu)建至敲除載體pkc1139，獲得tagr基因敲除質(zhì)粒pkc1139-δtagr；

23、使用大腸桿菌e.coil?et12567/puz8002介導(dǎo)的大腸桿菌-鏈霉菌種間接合轉(zhuǎn)移技術(shù)，將tagr基因敲除質(zhì)粒pkc1139-δtagr導(dǎo)入dpte突變型玫瑰孢鏈霉菌中，獲得所述工程菌株；

24、所述步驟s3)中，所述tagr蛋白編碼基因的堿基序列如seq?id?no.9所示。

25、(五)一種dpte突變蛋白及其編碼基因、達(dá)托霉素高產(chǎn)工程菌株的應(yīng)用

26、上述dpte突變蛋白、dpte突變蛋白編碼基因、達(dá)托霉素高產(chǎn)工程菌株均可用于發(fā)酵生產(chǎn)達(dá)托霉素。

27、(六)一種生產(chǎn)達(dá)托霉素的方法

28、所述生產(chǎn)達(dá)托霉素的方法包括以下步驟：采用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)達(dá)托霉素高產(chǎn)工程菌株，培養(yǎng)70h～74h后，每隔12h按照1‰～4‰的體積比向發(fā)酵培養(yǎng)基中滴加癸酸混合液(即癸酸混合液的體積：發(fā)酵培養(yǎng)基的體積＝1～4：1000)，培養(yǎng)結(jié)束后獲得發(fā)酵產(chǎn)物，從所述發(fā)酵產(chǎn)物中分離出非達(dá)霉素。

29、本發(fā)明通過挖掘玫瑰孢鏈霉菌蛋白巴豆酰化后修飾組學(xué)，發(fā)現(xiàn)并根據(jù)達(dá)托霉素生物合成蛋白dpte巴豆?；揎椢稽c(diǎn)(454位賴氨酸)進(jìn)行蛋白理性改造。dpte蛋白能將amp連接至毒性前體癸酸末端羧基，活化的癸酰基能被下游dptf蛋白進(jìn)一步呈遞給達(dá)托霉素nrps合酶，從而開啟達(dá)托霉素生物合成，因此dpte是達(dá)托霉素生物合成過程的關(guān)鍵起始蛋白和重要限速酶，并通過消耗毒性癸酸間接保護(hù)菌體。本發(fā)明通過蛋白質(zhì)工程手段提升了dpte蛋白將癸酸催化為癸酰amp的活性，增加了菌體癸酸利用效率，顯著提升了菌株的達(dá)托霉素產(chǎn)量。tagr蛋白是基于玫瑰孢鏈霉菌dna甲基化修飾組篩選到的負(fù)調(diào)控因子，負(fù)責(zé)調(diào)控磷壁酸abc轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，與菌體的環(huán)境壓力響應(yīng)關(guān)系密切。本發(fā)明通過敲除tagr蛋白編碼基因進(jìn)一步增加了菌體對毒性前體癸酸的耐受能力，進(jìn)而顯著降低達(dá)托霉素的生產(chǎn)成本。

30、本發(fā)明的有益效果是：

31、1、本發(fā)明提供的dpte突變蛋白及其編碼基因能夠提高宿主菌的達(dá)托霉素產(chǎn)量，并提高宿主菌對癸酸前體的耐受性。

32、2、本發(fā)明提供的高癸酸耐受性的達(dá)托霉素高產(chǎn)工程菌株，其達(dá)托霉素產(chǎn)量相比未經(jīng)dpte蛋白突變的菌株顯著提升了132％。該菌株對有毒前體癸酸的耐受性明顯提高，為工業(yè)發(fā)酵過程中的原料利用和菌株穩(wěn)定性提供了有力保障，有利于工業(yè)生產(chǎn)中通過癸酸流加工藝開發(fā)等下游技術(shù)手段進(jìn)一步提高達(dá)托霉素產(chǎn)量。

33、3、本發(fā)明方法避免了傳統(tǒng)誘變育種周期長，人力物力消耗大的缺點(diǎn)，且大大降低了達(dá)托霉素的生產(chǎn)成本，在工業(yè)化生產(chǎn)過程中有重要的應(yīng)用價值。

34、4、本發(fā)明提供的工程菌株的構(gòu)建方法，不僅能為達(dá)托霉素的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)提供穩(wěn)定、可靠的工程菌株，還對脂肽類抗生素的高產(chǎn)策略開發(fā)具有啟發(fā)意義和明確的應(yīng)用價值。