本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及用于質(zhì)粒dna殘留檢測的引物探針組合及其應(yīng)用和試劑盒。

背景技術(shù)：

1、隨著近些年細胞治療、基因治療的快速發(fā)展，慢病毒、腺相關(guān)病毒(adeno-associated?virus，aav)等病毒載體的應(yīng)用越來越廣泛。一般在病毒載體的生產(chǎn)過程中要用到多質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的過程，殘留的質(zhì)粒dna存在基因片段的自我復(fù)制和隨機插入機體基因組內(nèi)的風(fēng)險。所以，監(jiān)管機構(gòu)會嚴(yán)格控制病毒類載體的質(zhì)粒dna殘留。

2、現(xiàn)有技術(shù)中存在三種質(zhì)粒dna殘留檢測方法：dna探針雜交法、picogreen熒光法和定量pcr法。其中，dna探針雜交法存在樣品干擾導(dǎo)致假陽性、檢測量低估、方法不穩(wěn)定、檢測時間過長等問題；熒光染色法存在特異性低、抗干擾差的問題。定量pcr法(簡稱qpcr法)，也是生物制品中常用的dna殘留量的檢測方法。定量pcr法用于質(zhì)粒dna殘留的檢測方法為：重組aav病毒樣品經(jīng)蛋白酶k預(yù)處理后，配制pcr反應(yīng)體系后，分別用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線、預(yù)處理的樣品稀釋后，加入到分裝的pcr反應(yīng)體系中，進行pcr擴增，通過擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線回算重組aav病毒樣品中質(zhì)粒dna殘留量。但是，定量pcr法用標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量檢測時誤差較大，因樣品與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴增效率的差異等，同時因額外建立標(biāo)準(zhǔn)品并定量，增加了方法建立周期和成本。存在標(biāo)準(zhǔn)品的制備，擴增效率的不一致性等。

3、數(shù)字pcr技術(shù)不需要額外建立標(biāo)準(zhǔn)品，其檢測不受引物擴增效率的影響，以往的腺相關(guān)病毒等病毒檢測過程涉及到較復(fù)雜的樣品處理，如核酸酶消化殼外dna后蛋白酶裂解病毒衣殼等。數(shù)字pcr技術(shù)用于重組aav病毒中質(zhì)粒dna殘留檢測不需要額外的樣品預(yù)處理，同時可獲得準(zhǔn)確可重復(fù)的檢測數(shù)據(jù)。因此，提供基于數(shù)字pcr技術(shù)，提供一種快速、穩(wěn)定的質(zhì)粒dna殘留檢測的方法備受關(guān)注。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本發(fā)明提供了用于質(zhì)粒dna殘留檢測的引物探針組合及其應(yīng)用和試劑盒。本發(fā)明提供的引物探針組合中包括引物對和探針；所述的引物對具有如seqid?no.1-2或seq?id?no.4-5所示的核苷酸序列，所述的探針具有如seq?id?no.3或seq?idno.6所述的核苷酸序列。本發(fā)明提供的引物探針組合制備得到的試劑盒可用于慢病毒、γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或腺相關(guān)病毒載體中的質(zhì)粒dna殘留的檢測，不需要額外建立標(biāo)準(zhǔn)品，不需要額外的樣品預(yù)處理，同時可獲得準(zhǔn)確可重復(fù)的檢測數(shù)據(jù)，具有較好的重復(fù)性和精密度。

2、術(shù)語：

3、1、微滴式數(shù)字pcr(droplet?digital?polymerase?chain?reaction,ddpcr)；

4、2、復(fù)制起始位點(origin?of?replication，ori)。

5、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

6、第一方面，本發(fā)明提供了一種用于質(zhì)粒dna殘留檢測的引物探針組合，其特征在于，所述的引物探針組合中包括引物對和探針；

7、所述的引物對具有如seq?id?no.1-2所示的核苷酸序列，所述的探針具有如seqid?no.3所述的核苷酸序列；或

8、所述的引物對具有如seq?id?no.4-5所示的核苷酸序列，所述的探針具有如seqid?no.6所述的核苷酸序列。

9、具體地，所述的引物探針組合的引物對包括正向引物和反向引物。

10、優(yōu)選地，所述的正向引物包括如seq?id?no.1或seq?id?no.4所示的核苷酸序列。

11、優(yōu)選地，所述的反向引物包括如seq?id?no.2或seq?id?no.5所示的核苷酸序列。

12、具體地，所述的引物探針組合中正向引物、反向引物和探針的濃度比為2：2：1。

13、具體地，所述的探針可在5'端或3'端標(biāo)記熒光基團或淬滅基團。

14、進一步具體地，所述的熒光基團選自fam、vic、tet、cal?gold?540、joe、hex、tamra、rox、cy3或cy5；所述淬滅基團選自dabcyl、bhq1、bhq2、bhq3或eclipe。

15、優(yōu)選地，所述的熒光基團為fam，所述的淬滅基團為bhq1。

16、優(yōu)選地，所述的探針在5'端標(biāo)記熒光基團，在3'端標(biāo)記淬滅基團。

17、第二方面，本發(fā)明提供了上述的引物探針組合在制備試劑盒中的應(yīng)用。

18、第三方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，所述的試劑盒包括上述的引物探針組合。

19、具體地，所述的試劑盒中還包括ddpcr預(yù)混反應(yīng)液體，數(shù)字pcr專用96孔板。

20、第四方面，本發(fā)明提供了上述的試劑盒在質(zhì)粒dna殘留檢測中的應(yīng)用。

21、具體地，所述的試劑盒用于檢測慢病毒、γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或腺相關(guān)病毒載體中的質(zhì)粒dna殘留。

22、優(yōu)選地，所述的試劑盒用于檢測腺相關(guān)病毒中的質(zhì)粒dna殘留。

23、第五方面，本發(fā)明提供了一種質(zhì)粒dna殘留檢測的方法，所述的方法包括使用上述的引物探針組合或試劑盒。

24、具體地，所述的包括如下步驟：

25、(1)將待測樣品梯度稀釋后，與含有引物探針組合的反應(yīng)混合液混勻，渦旋后離心，生成微滴；

26、(2)進行pcr擴增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后讀取樣品的拷貝數(shù)；

27、(3)根據(jù)樣品的拷貝數(shù)計算質(zhì)粒dna殘留量。

28、進一步具體地，步驟(1)中所述的稀釋所用的溶液為無核酸酶水。

29、優(yōu)選地，步驟(1)中所述的稀釋所用的溶液為含0.05％p-f68無核酸酶水。

30、進一步具體地，步驟(1)中所述的含有引物探針組合的反應(yīng)混合液與稀釋后的樣品的體積比為1-5：1。

31、優(yōu)選地，步驟(1)中所述的含有引物探針組合的反應(yīng)混合液與稀釋后的樣品的體積比為3：1。

32、進一步具體地，步驟(1)中所述的含有引物探針組合的反應(yīng)混合液的制備方法為：將ddpcr?2x?supermix、引物、探針及水混合。

33、優(yōu)選地，所述的引物具有如seq?id?no.1-2或seq?id?no.4-5所示的核苷酸序列。

34、優(yōu)選地，所述的探針具有如seq?id?no.3或seq?id?no.6所示的核苷酸序列。

35、優(yōu)選地，所述的pcr擴增的條件如下：

36、s1、95℃反應(yīng)10min，升溫速度為2℃/s；

37、s2、94℃反應(yīng)30s，升溫速度為2℃/s；

38、s3、60℃反應(yīng)1min，升溫速度為2℃/s；

39、s4、步驟s2-s3設(shè)置40個循環(huán)反應(yīng)；

40、s5、98℃反應(yīng)10min，升溫速度為2℃/s。

41、本發(fā)明具有以下有益效果：

42、本發(fā)明提供的引物探針組合制備得到的試劑盒可用于慢病毒、γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或腺相關(guān)病毒載體中的質(zhì)粒dna殘留的檢測，不需要額外建立標(biāo)準(zhǔn)品，不需要額外的樣品預(yù)處理，同時可獲得準(zhǔn)確可重復(fù)的檢測數(shù)據(jù)，具有較好的重復(fù)性和精密度。