本發(fā)明屬于土壤修復(fù)，尤其涉及一種修復(fù)鉛鎘污染土壤的微生物復(fù)合劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、土壤是人類(lèi)賴(lài)以生存的基礎(chǔ)。但由于人類(lèi)長(zhǎng)期的不合理施肥以及工業(yè)活動(dòng)，有害元素不斷釋放入侵土壤環(huán)境，導(dǎo)致眾多地區(qū)的土壤環(huán)境面臨著嚴(yán)重的重金屬污染問(wèn)題。其中鉛、鎘屬于五大重點(diǎn)監(jiān)控的重金屬，在土壤中往往產(chǎn)生疊加毒害效應(yīng)，長(zhǎng)期滯留在土壤中會(huì)影響土壤質(zhì)量、農(nóng)作物品質(zhì)，甚至危害人體健康。

2、重金屬污染土壤修復(fù)技術(shù)主要包括物理、化學(xué)、生物修復(fù)技術(shù)。其中微生物修復(fù)技術(shù)具有成本低廉、操作簡(jiǎn)單、無(wú)二次污染等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)被廣泛關(guān)注。當(dāng)前微生物修復(fù)技術(shù)在重金屬污水處理中的應(yīng)用已較為成熟，但在重金屬土壤修復(fù)中仍存在局限，主要體現(xiàn)在微生物因無(wú)法適應(yīng)復(fù)雜的土壤環(huán)境而流失或失活。如何增強(qiáng)微生物修復(fù)技術(shù)在土壤中的作用已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

3、微生物固定化技術(shù)是指利用物理或化學(xué)的手段將游離的微生物限制于某特定的載體空間，使微生物保持活性的同時(shí)免受外界的脅迫，在微生物技術(shù)修復(fù)土壤的領(lǐng)域廣受青睞。微生物固定化載體分為有機(jī)型和無(wú)機(jī)型，相比于有機(jī)型，無(wú)機(jī)型傳質(zhì)更好、價(jià)格低廉且無(wú)毒無(wú)害，更適合應(yīng)用在土壤修復(fù)中。然而，以往的無(wú)機(jī)型載體機(jī)械強(qiáng)度不高且容易破碎，使用壽命短，難以長(zhǎng)期抵抗外界環(huán)境損傷。此外，固定微生物后難以實(shí)現(xiàn)協(xié)同增效的作用。因此，必須尋求更加穩(wěn)定高效的微生物固定化技術(shù)，才能使其更好地應(yīng)用于重金屬土壤修復(fù)處理當(dāng)中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種修復(fù)鉛鎘污染土壤的微生物復(fù)合劑及其制備方法，所述微生物復(fù)合劑由無(wú)機(jī)載體負(fù)載微生物菌制得，具有較高的力學(xué)性能和微生物固定率，其應(yīng)用于重金屬土壤修復(fù)當(dāng)中，可以達(dá)到鈍化重金屬、改良土壤理化性質(zhì)的技術(shù)效果。

2、一種修復(fù)鉛鎘污染土壤的微生物復(fù)合劑的制備方法，包括如下步驟：

3、1、無(wú)機(jī)載體的制備

4、按照質(zhì)量比4:3:3依次稱(chēng)取電解錳渣、膨潤(rùn)土、蘇打粉，置于研缽中研磨，混合均勻后，分5次噴灑蒸餾水；蒸餾水噴灑完畢后手工造粒，所得顆粒粒徑為3-4mm；隨后，將所得顆粒置于恒溫培養(yǎng)箱中陳化，再轉(zhuǎn)移至馬弗爐焙燒；自然冷卻后取出，以蒸餾水清洗焙燒所得的顆粒，再超聲清洗以剔除雜質(zhì)，將經(jīng)超聲清洗的顆粒置于烘箱中烘干至恒重，得到無(wú)機(jī)載體。

5、2、微生物菌菌液的制備

6、(2.1)在無(wú)菌操作下，按照土壤樣品:超純水的質(zhì)量/體積比1g:10ml稱(chēng)取土壤樣品、超純水，將稱(chēng)取的土壤樣品和量取的超純水加入到三角瓶中，然后振蕩，獲得土壤混合液；所述土壤樣品中pb2+濃度為25mg/kg、cd2+濃度為0.56mg/kg；

7、(2.2)將三角瓶放至超凈臺(tái)靜置，靜置后的上清液作為鉛鎘鈍化微生物的來(lái)源；

8、(2.3)微生物菌的耐鉛馴化：移取步驟(2.2)獲得的上清液，將其接種到裝有l(wèi)b液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，再加入鉛溶液，使得體系的最終體積為100ml，其中鉛濃度為50mg/l；將錐形瓶封口后置入恒溫?fù)u床中，振蕩培養(yǎng)；然后，在超凈臺(tái)中移取培養(yǎng)后獲得的菌液涂布于鉛濃度為50mg/l的lb固體培養(yǎng)基平板上，平板劃線后封口倒置，紫外線照射3-5min后，將倒置的平板放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，到此完成第一耐鉛馴化周期。

9、根據(jù)菌落的形態(tài)及顯微鏡檢查，使用接種環(huán)從完成第一培養(yǎng)周期的微生物菌中挑取生長(zhǎng)量最多的具有微透明邊緣的淡黃色單菌落接種到裝有l(wèi)b液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，再加入所述鉛溶液，使得體系的最終體積為100ml，其中鉛濃度為100mg/l；將錐形瓶封口后置入恒溫?fù)u床中，振蕩培養(yǎng)；然后，在超凈臺(tái)中，錐形瓶?jī)?nèi)取100μl培養(yǎng)后獲得的菌液分別涂布于鉛濃度為100mg/l的lb固體培養(yǎng)基平板上，平板劃線后封口倒置，紫外線照射3-5min后，將倒置的平板放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，到此完成第二耐鉛馴化周期。

10、上述操作過(guò)程依次類(lèi)推，lb液體培養(yǎng)基和lb固體培養(yǎng)基中鉛濃度依次為150、200、300、400mg/l，依次完成第三、四、五、六耐鉛馴化周期。

11、(2.4)微生物菌的耐鎘馴化：根據(jù)菌落的形態(tài)及顯微鏡檢查，使用接種環(huán)從完成步驟(2.3)的第六培養(yǎng)周期的微生物菌中挑取生長(zhǎng)量最多的具有微透明邊緣的淡黃色單菌落接種到裝有l(wèi)b液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，再加入鎘溶液，使得體系的最終體積為100ml，其中鎘濃度為50mg/l；將錐形瓶封口后置入恒溫?fù)u床中，振蕩培養(yǎng)；然后，在超凈臺(tái)中，移取錐形瓶中培養(yǎng)后獲得的菌液涂布于鎘濃度為50mg/l的lb固體培養(yǎng)基平板上，平板劃線后封口倒置；紫外線照射3-5min后，將倒置的平板放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，到此完成第一耐鎘馴化周期；

12、根據(jù)菌落的形態(tài)及顯微鏡檢查，使用接種環(huán)從完成第一耐鎘馴化周期的微生物菌中挑取生長(zhǎng)量最多的具有微透明邊緣的淡黃色單菌落接種到裝有l(wèi)b液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，再加入鎘溶液，使得體系的最終體積為100ml，其中鎘濃度為100mg/l；將錐形瓶封口后置入恒溫?fù)u床中，振蕩培養(yǎng)；然后，在超凈臺(tái)中，移取錐形瓶中100μl培養(yǎng)后獲得的菌液涂布于鎘濃度為100mg/l的lb固體培養(yǎng)基平板上，平板劃線后封口倒置；紫外線照射3-5min后，將倒置的平板放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，到此完成第二耐鎘馴化周期；

13、上述操作過(guò)程依次類(lèi)推，lb液體培養(yǎng)基和lb固體培養(yǎng)基中鎘濃度依次為150、200、300、400mg/l，依次完成第三、四、五、六耐鎘馴化周期。

14、(2.5)使用接種環(huán)從步驟(2.4)得到的完成第六耐鎘馴化周期的微生物菌中挑取生長(zhǎng)量最多的具有微透明邊緣的淡黃色單菌落置于pb2+濃度為400mg/l、cd2+濃度為400mg/l的lb固體培養(yǎng)基平板上，平板劃線后封口倒置，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，使用接種環(huán)從lb固體培養(yǎng)基平板上挑取生長(zhǎng)量最多的具有微透明邊緣的淡黃色單菌落，將其置于100ml?lb液體培養(yǎng)基中，后于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，得到菌液，所得菌液中微生物菌含量為2.2×108cfu/ml。

15、3、微生物復(fù)合劑的制備

16、將步驟1制得的無(wú)機(jī)載體置于錐形瓶中，加入lb液體培養(yǎng)基后滅菌；移取步驟2得到的菌液，將其添加入上述錐形瓶中，調(diào)節(jié)錐形瓶中ph為弱酸性，再將該錐形瓶放入恒溫?fù)u床中，振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，采用離心機(jī)4000-6000rpm下離心3-5min；離心后去除上層液體，以pbs緩沖液清洗錐形瓶瓶底固形物3-5次，再置于干燥箱中干燥至恒重，得到微生物復(fù)合劑。

17、優(yōu)選地，步驟1中，分5次噴灑蒸餾水的具體過(guò)程為：每次噴灑蒸餾水量相同、且每次噴灑蒸餾水后攪拌均勻，5次噴灑蒸餾水總質(zhì)量為所稱(chēng)取的電解錳渣、膨潤(rùn)土、蘇打粉總質(zhì)量的40％。恒溫培養(yǎng)箱中陳化溫度為25℃、陳化時(shí)間為24h；馬弗爐中焙燒溫度為1000℃、焙燒時(shí)間為2h；烘干溫度為60℃。

18、優(yōu)選地，步驟2.1中，振蕩的工藝條件為：30℃、180rpm.

19、優(yōu)選地，步驟2.3中，所述鉛溶液的濃度為1g/l，上清液的體積：濃度為1g/l的鉛溶液體積為2:5，振蕩的工藝條件為：30℃、180rpm，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)溫度為30℃、時(shí)間為2天。

20、優(yōu)選地，步驟2.4中，振蕩的工藝條件為：30℃、180rpm；所述鎘溶液的濃度為1g/l，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)溫度為30℃、時(shí)間為2天。

21、優(yōu)選地，步驟2.5中，所述放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)具體為放入恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)2天，所述恒溫?fù)u床中培養(yǎng)具體為150rpm、30℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)2天。

22、優(yōu)選地，步驟3中，錐形瓶中l(wèi)b液體培養(yǎng)基：無(wú)機(jī)載體：菌液的比例為100ml:0.8g:2ml，調(diào)節(jié)錐形瓶中ph為5，振蕩的工藝條件為：30℃、150rpm，干燥溫度為35℃。

23、本發(fā)明提供由上述制備方法制得的修復(fù)鉛鎘污染土壤的微生物復(fù)合劑。

24、本發(fā)明提供上述微生物復(fù)合劑在修復(fù)鉛鎘污染土壤中的應(yīng)用。

25、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

26、1、本發(fā)明的無(wú)機(jī)載體顆粒為多孔結(jié)構(gòu)，其中，電解錳渣作為主要基體，蘇打粉的加入一方面能活化電解錳渣中的非活性硅，形成網(wǎng)狀膠凝結(jié)構(gòu)，提高原本的活性位點(diǎn)和表面積，另一方面能夠在高溫中形成部分氣體以提升基體孔隙率；膨潤(rùn)土的加入能夠補(bǔ)充硅鋁組分，并且在顆粒組裝過(guò)程中提供粘接作用，最終提高顆粒強(qiáng)度。三者缺一則無(wú)法達(dá)到無(wú)機(jī)多孔顆粒的最優(yōu)效果。

27、2、本發(fā)明的微生物復(fù)合劑中的無(wú)機(jī)載體無(wú)毒無(wú)害、穩(wěn)定性強(qiáng)、孔隙率高且不易開(kāi)裂，與微生物菌契合度較高，便于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的富集和微生物的固定，并且固定微生物的密度高，可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化制作生產(chǎn)。

28、3、本發(fā)明的微生物復(fù)合劑，其組分包括無(wú)機(jī)載體顆粒及其負(fù)載的微生物菌，比單一的無(wú)機(jī)載體顆?；騿我坏奈⑸锞?，對(duì)鉛鎘污染土壤的處理效果更優(yōu)，增強(qiáng)了鉛、鎘復(fù)合污染土壤的修復(fù)效果，改善了土壤的基本理化性質(zhì)和酶活性。與常見(jiàn)的不同，本發(fā)明中采用的負(fù)載方法，邊負(fù)載微生物菌邊培養(yǎng)，有利于微生物菌在其處于微小(早期)狀態(tài)時(shí)進(jìn)入無(wú)機(jī)載體的孔洞，然后培養(yǎng)過(guò)程中，進(jìn)入無(wú)機(jī)載體的孔洞中微生物菌逐漸長(zhǎng)大，向孔洞內(nèi)部和外部生長(zhǎng)，填滿孔洞，與孔洞成為一體，有效地增加了所負(fù)載的微生物菌量，獲得更優(yōu)的鈍化效果。如果僅負(fù)載而沒(méi)有培養(yǎng)過(guò)程，負(fù)載早期狀態(tài)的微生物菌，則微生物菌較小，活性不高，負(fù)載成熟期的微生物菌，因微生物菌個(gè)體較大，不易進(jìn)入較小的孔洞，負(fù)載量降低。

29、4、本發(fā)明的微生物復(fù)合劑容易操作且便于回收，不產(chǎn)生二次污染，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值高，能夠廣泛應(yīng)用于重金屬污染土壤治理領(lǐng)域。