本發(fā)明屬于分子生物學(xué)的，尤其涉及一種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體及其構(gòu)建方法、構(gòu)建體、突變體表達菌株、應(yīng)用和萊鮑迪苷m的制備方法。

背景技術(shù)：

1、甜葉菊是一種源于南美洲的菊科草本植物，其所含的甜菊糖苷具有甜度高、熱量極低、穩(wěn)定性好等特點，被譽為“第三代健康糖源”和“最佳天然甜味劑”。甜菊糖苷主要存在于甜葉菊葉片中，含量最多的為甜菊苷stevioside(占葉片干重的5～10％)、萊鮑迪苷a(rebaudioside?a)(占葉片干重的2～4％)和萊鮑迪苷c(rebaudioside?c)(占葉片干重的1～2％)，其余的50多種糖苷如萊鮑迪苷d、萊鮑迪苷m、萊鮑迪苷e等則含量極低。

2、甜菊糖苷甜度約為蔗糖的200～350倍，而熱量僅為蔗糖的200～300分之一，是一種優(yōu)質(zhì)的甜味劑替代品，已被應(yīng)用于巧克力、酸奶、果醬、飲料中。研究表明，甜菊糖苷在輔助治療糖尿病、高血壓、結(jié)腸炎、肝硬化等方面均有作用，故甜菊糖苷在食品、飲品及藥物領(lǐng)域具備廣闊應(yīng)用空間。

3、甜菊糖苷具有共同的甜菊醇單元，在此結(jié)構(gòu)上通過在甜菊醇單元的c-13和c-19位上添加不同數(shù)量和類型的糖基，形成口味及理化性質(zhì)各異的多種甜菊糖苷。由于甜菊苷和萊鮑迪苷a具有后苦味，所以萊鮑迪苷d、萊鮑迪苷m被認(rèn)為是較理想的甜味劑。而依據(jù)甜度及口感排序，萊鮑迪苷m要優(yōu)于萊鮑迪苷d和萊鮑迪苷a。

4、由于萊鮑迪苷m在植物中含量極低，故不能通過植物提取方法進行提取，且化學(xué)合成法工藝復(fù)雜、耗能高且對環(huán)境有害，亦不利于萊鮑迪苷m的大規(guī)模生產(chǎn)。葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶是在酶反應(yīng)中只轉(zhuǎn)移葡萄糖基的酶，該酶的作用機理是催化糖基供體的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到糖基受體分子上，從而調(diào)節(jié)受體分子的活性。葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶可被應(yīng)用于萊鮑迪苷m的制備中以實現(xiàn)其生物催化合成。通過生物催化合成法生產(chǎn)萊鮑迪苷m具有生產(chǎn)規(guī)模大、時間短、環(huán)境友好等特點。但是，目前生物催化合成法中所使用的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶多為來源于植物細胞中的野生酶，往往存在酶活低的缺點，從而導(dǎo)致其應(yīng)用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)萊鮑迪苷m的成本較高。

5、因此，對來源于植物細胞的野生葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶進行改造，有效地提高酶活，有利于實現(xiàn)萊鮑迪苷m的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的第一目的在于提供一種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體。該葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體具有優(yōu)秀的酶活，能夠與現(xiàn)有的蔗糖合成酶協(xié)同配合，利用蔗糖、萊鮑迪苷d和尿苷二磷酸作為原料，以實現(xiàn)萊鮑迪苷m的高效率、低成本的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

2、本發(fā)明的第二目的在于提供上述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的構(gòu)建方法。

3、本發(fā)明的第三目的在于提供一種構(gòu)建體。

4、本發(fā)明的第四目的在于提供一種突變體表達菌株。

5、本發(fā)明的第五目的在于提供上述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體和/或突變體表達菌株在生產(chǎn)萊鮑迪苷m中的應(yīng)用。

6、本發(fā)明的第六目的在于提供一種萊鮑迪苷m的制備方法。

7、具體的，相較于包括序列如seq?id?no:1所示的氨基酸片段的原始葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，本發(fā)明提供的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體包括l79t突變、s195v突變和y387v突變中的一種或多種。

8、進一步地，所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體包括l79t突變，所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體包括序列如seq?id?no:2所示的氨基酸片段。

9、進一步地，所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體包括s195v突變，所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體包括序列如seq?id?no:3所示的氨基酸片段。

10、進一步地，所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體包括y387v突變，所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體包括序列如seq?id?no:4所示的氨基酸片段。

11、進一步地，所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體包括l79t突變、s195v突變和y387v突變，所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體包括序列如seq?id?no:5所示的氨基酸片段。

12、本發(fā)明提供的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的構(gòu)建方法包括：基于所述原始葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因進行定點突變，構(gòu)建得到包括所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的編碼基因的構(gòu)建體；取所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得到突變體表達菌株；取所述突變體表達菌株進行誘導(dǎo)表達，得到所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體。

13、進一步地，所述原始葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因包括序列如seq?id?no:6所示的核苷酸片段。

14、進一步地，所述定點突變的引物包括l79t突變引物對、s195v突變引物對和y387v突變引物對的一種或多種。

15、進一步地，所述l79t突變引物對包括序列如seq?id?no:7所述的引物l79t-f和seqid?no:8所示的引物l79t-r。

16、進一步地，所述s195v突變引物對包括序列如seq?id?no:9所述的引物s195v-f和序列如seq?id?no:10所示的引物s195v-r。

17、進一步地，所述y387v突變引物對包括序列如seq?id?no:11所述的引物y387v-f和序列如seq?id?no:12所示的引物y387v-r。

18、本發(fā)明提供的構(gòu)建體包括上述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的編碼基因。

19、本發(fā)明提供的突變表達菌株能夠表達上述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體。

20、本發(fā)明還提供了上述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體和/或突變體表達菌株在生產(chǎn)萊鮑迪苷m中的應(yīng)用。

21、本發(fā)明提供的萊鮑迪苷m的制備方法包括：取復(fù)合酶液和原料液混合，進行酶催化反應(yīng)，得到所述萊鮑迪苷m；其中，所述復(fù)合酶液包括蔗糖合成酶和上述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，所述原料液包括蔗糖、萊鮑迪苷d和尿苷二磷酸。

22、進一步地，所述原料液中蔗糖、萊鮑迪苷d和尿苷二磷酸的摩爾比為(200～600):(10～100):(1～10)。

23、進一步地，所述復(fù)合酶液中葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體和蔗糖合成酶的質(zhì)量比為(1～10):1。

24、進一步地，所述蔗糖合成酶包括序列如seq?id?no:13所示的氨基酸片段。

25、進一步地，所述復(fù)合酶液的添加濃度為1～5mg/ml，且所述復(fù)合酶液的酶總濃度為20～60mg/ml。

26、進一步地，所述酶催化反應(yīng)的溫度為35～60℃，時間為24～48h。

27、有益效果：

28、本發(fā)明中是以來源于甜菊(stevia?rebaudiana)的原始葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(氨基酸序列如seq?id?no:1所示)為基礎(chǔ)進行蛋白質(zhì)定向進化，引入l79t突變、s195v突變和/或y387v突變，優(yōu)化酶分子的空間結(jié)構(gòu)，以提高其所具有的底物結(jié)合能力和轉(zhuǎn)葡萄糖基催化能力，從而獲得一種具有優(yōu)秀酶活的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體。該葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體可被很好地應(yīng)用于萊鮑迪苷m的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。

29、在一些優(yōu)選的實施方式中，采用蔗糖合成酶與上述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體復(fù)配并以蔗糖、萊鮑迪苷d和尿苷二磷酸(udp)作為底物進行多級聯(lián)酶催化反應(yīng)，利用蔗糖合成酶催化udp和蔗糖反應(yīng)生成果糖和udp-葡萄糖(udpg)，所生成的udp-葡萄糖作為萊鮑迪苷d的糖基供體在葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的高效催化作用下參與糖基化反應(yīng)，從而制備得到萊鮑迪苷m，且udp和蔗糖反應(yīng)生成果糖和udp-葡萄糖的過程可逆，反應(yīng)體系中的udp-udpg可以被循環(huán)利用，在有效降低生產(chǎn)成本的同時，使得反應(yīng)體系中的udp和udp-葡萄糖處于動態(tài)平衡，降低了底物和產(chǎn)物對蔗糖合成酶、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的抑制作用，有利于實現(xiàn)萊鮑迪苷m的大規(guī)模、低成本生產(chǎn)。