本發(fā)明涉及白介素-2(il-2)變體，其用于預防或治療免疫病癥，諸如但不限于急性或慢性炎性疾病、過敏性疾病、自身免疫性疾病或感染性疾病、移植物抗宿主病、移植排斥反應和癌癥。本發(fā)明還涉及所述il-2變體用于篩選具有促(pro-)t效應細胞或促(pro-)t調(diào)節(jié)細胞活性的抗il-2抗體的用途。

背景技術：

1、白介素-2(il-2)是免疫應答的關鍵細胞因子，其促進t和b淋巴細胞(t和b細胞)的活化、增殖和存活。il-2受體(il-2r)是由α(il-2-ra或cd25)、β(il-2rb或cd122)和γ(il-2rg或γc或cd132)鏈組成的異三聚體蛋白質(zhì)復合物。α鏈以低親和力結合il-2并且不參與信號傳導。β鏈和γ鏈的組合形成了在負責細胞介導的免疫響應的效應t細胞(常規(guī)t細胞(tconv；cd4+foxp3-))、cd8+和nk細胞上表達的中等親和力受體；并且所有三個受體鏈形成在調(diào)節(jié)性t細胞(t調(diào)節(jié)細胞或treg；cd4+foxp3+)上組成型表達的高親和力受體，其具有免疫抑制功能，并由活化的效應t細胞和nk細胞短暫或瞬時表達。

2、實際上，il-2是具有免疫刺激和抑制功能的細胞因子。因此，其已在臨床中以高劑量刺激針對癌癥的免疫響應，且最近以低劑量阻斷各種病理生理學病癥中的免疫響應，所述病理生理學病癥包括自身免疫性疾病(諸如1型糖尿病(t1d))、自身免疫性血管炎、炎性疾病(諸如帕金森病)和寄生蟲感染(諸如克氏錐蟲感染)；和移植排斥反應，包括移植物抗宿主病(gvhd)(rosenberg?et?al.,sci.transl.med.,2012,4,127-；grinberg-bleyer,y.et?al.,j.exp.med.,2010,207,1871–1878；tang?et?al.,immunity,2008,28,687-697；pilon?et?al.,am.j.transplant.,2014,14,2874–2882；saadoun?et?al.,n.engl.j.med.,2011,365,2067–2077；koreth?et?al.,n.engl.j.med.,2011,365,2055–2066；kennedy-nasser?et?al.,clin.cancer?res.off.j.am.assoc.cancer?res.,2014,20,2215–2225；baeyens?et?al.,diabetes,2013,62,3120–3131；gonzález?et?al.,brain.behav.immun.,2015,45,219–232；pérol?et?al.,immunol.lett.,2014,162,173–184。

3、但是，高劑量的il-2在癌癥治療中可能是毒性很強的，并且由于il-2對treg的有害作用，其功效不是最佳的(5-20％的應答者)。

4、在人類中，已成功施用低劑量的il-2以促進tregs并抑制自身免疫性血管炎患者和移植物抗宿主病的炎癥(saadoun?et?al.；koreth,j.et?al.；kennedy-nasser?et?al.)。但是，由于il-2的半衰期很短，需要重復施用，因此需要進行改進。

5、有趣的是，當il-2與抗il-2抗體(ab)復合時，il-2藥效得到改進，其毒性降低，并且取決于ab，該復合物可以將il-2作用重定向至效應子(促teff抗il-2ab)或調(diào)控性(促treg抗il-2ab)免疫細胞，從而解決與基于il-2的療法相關的主要問題(boyman?et?al.,science,2006,311,1924–1927.letourneau?et?al.,proc.natl.acad.sci.,2010,107,2171–2176)。關于作用機制，顯示與促teff抗il-2抗體形成復合物直接阻斷il-2與cd25的相互作用(levin?et?al.,nature,2012,484,529–533；rojas,g.in?monoclonalantibodies(eds.ossipow,v.&fischer,n.)1131,447–476(humana?press,2014))。

6、treg-定向的il-2/抗il-2復合物在不同的小鼠炎癥模型中給出了令人印象深刻的結果：t1d、哮喘、eae、動脈粥樣硬化、慢性腎病和移植，包括實體器官移植(webster?etal.,j.exp.med.,2009,206,751–760；dinh,t.n.et?al.,circulation,2012,126,1256–1266；polhill,t.et?al.j.am.soc.nephrol.jasn,2012,23,1303–1308；satake?et?al.,plos?one,2014,9,e92888；vokaer?et?al.,transplant.proc.,2012,44,2840–2844；goldstein?et?al.,front.immunol.,2013,4,155)。

7、另一種微調(diào)il-2生物活性的策略在于在il-2分子中進行點狀突變以產(chǎn)生il-2變體或突變體il-2。已經(jīng)公開了包含五個點狀突變的突變體il-2蛋白(il-2超因子)，其賦予與野生型il-2相比對cd122高300倍的親和力(levin?et?al.,nature,2012,484,529–533)。還公開了對il-2ra(cd25)具有更大親和力和/或通過il-2rbg改變信號傳導的免疫抑制性il-2變體(wo2010/085495和us2014/0286898)。

8、為了改進基于il-2的免疫治療，需要用于預防或治療免疫疾病的il-2變體。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明人已經(jīng)將人il-2的表面重構變體工程化并鑒定了能夠優(yōu)選刺激t-調(diào)節(jié)性(treg)細胞或拮抗il-2的il-2變體。

2、本技術的實施例顯示了人il-2的表面重構變體(treg-激動劑變體)，其在體外優(yōu)選刺激treg(圖6)并在體內(nèi)增加小鼠中的循環(huán)treg細胞(圖10)。treg-激動劑變體可用于通過優(yōu)選激活treg而間接降低免疫激活，進而反過來抑制免疫效應細胞。因此，本發(fā)明的treg-激動劑變體可用于治療其中免疫調(diào)節(jié)或免疫抑制是有益的疾病，諸如但不限于過敏性和自身免疫性疾病，和包含免疫系統(tǒng)過度活化的疾病，其特別包括慢性或急性炎性疾病、移植物抗宿主病(gvhd)和移植排斥反應。

3、本技術的實施例還顯示一些人il-2的表面重構變體是il-2拮抗劑(圖9)。

4、在包括與過度產(chǎn)生il-2相關的免疫系統(tǒng)過度活化的疾病(特別包括慢性或急性炎性疾病、移植物抗宿主病(gvhd)和移植排斥反應)的情況下，根據(jù)本發(fā)明的il-2拮抗劑變體通過與內(nèi)源性il-2競爭直接降低免疫活化，從而阻斷il-2介導的免疫系統(tǒng)過度活化。

5、在急性gvhd的鼠模型中，本發(fā)明的il-2變體，無論是treg激動劑還是il-2拮抗劑，都可以控制gvhd并延遲臨床gvhd發(fā)展。與測試的treg-激動劑變體相比，測試的il-2-拮抗劑變體在阻止體重減輕和優(yōu)選增加循環(huán)人treg細胞方面更有效(圖7和圖8)。

6、此外，作為il-2拮抗劑的il-2變體通過將它們從野生型il-2信號傳導中去除而在體外抑制treg分裂(類似于阻斷抗il-2抗體；圖12)。在體內(nèi)，預期用本發(fā)明的il-2拮抗劑變體抑制treg將減少腫瘤生長，如先前用其它il-2拮抗劑所示(carmenate?et?al.,thejournal?of?immunology,2018,200,3475-3484)。根據(jù)本發(fā)明的il-2拮抗劑變體對treg的抑制將因此通過從treg抑制中釋放免疫細胞來促進免疫響應(淋巴細胞(b、nk、cd4+或cd8+t細胞)；樹突細胞(dc)；巨噬細胞等)。此外，取決于所用的il-2拮抗劑變體的劑量，cd8+t細胞功能被保留或適度地受影響(圖9；圖12)。因此，il-2拮抗劑變體進一步允許直接刺激cd8+t細胞免疫應答，例如針對腫瘤、病原體或疫苗。由于所有這些原因，用本發(fā)明的il-2-拮抗劑變體預期對癌癥、感染劑和疫苗有更好的免疫應答。

7、總之，本技術中給出的結果表明，il-2拮抗劑變體在體內(nèi)的作用可以根據(jù)免疫環(huán)境而變化，因為當免疫系統(tǒng)過度活化并產(chǎn)生過量的il-2時，其降低免疫活化(通過中和過量的內(nèi)源性il-2)，而在不同的免疫環(huán)境中，其增加免疫活化(通過treg抑制和cd8+t細胞活化)。由于這些原因，il-2拮抗劑變體可用于治療包括與過度產(chǎn)生il-2相關的免疫系統(tǒng)的過度活化的疾病，諸如但不限于慢性或急性炎性疾病、移植物抗宿主病(gvhd)和移植排斥反應，并且還用于治療癌癥和感染性疾病和增加對疫苗的免疫應答。

8、本發(fā)明人還解決了一些變體的晶體結構，這給出了對其作用機制的一些見解。本發(fā)明人觀察到y(tǒng)31p取代(il2-v4)使il-2穩(wěn)定在與il2-rα亞基復合物中觀察到的構象相似的構象中(下文稱為“α誘導構象”)。事實上，最近有一些來自鼠il-2的證據(jù)表明，tyr31所在的環(huán)ab中的構象變化會別構地影響與il-2rβ和γ亞基的相互作用(de?paula?et?al.,p.n.a.s.,doi/10.1073；march?17,2020and?spangler?et?al.,immunity,2015,42,815-825)。因而，很容易推測il2-v4活性背后的分子機制利用了這種別構回路。實際上，本發(fā)明人還獲得了與il2-v4具有相同活性的il2-v1的結構。盡管該變體中存在的突變都不位于ab環(huán)中，但其也顯示相同的“α誘導構象”。

9、不受理論的束縛，本發(fā)明人相信在本發(fā)明的il-2拮抗劑變體中引入的取代穩(wěn)定了結合形式并誘導構象變化，所述構象變化別構地影響與il-2rβ和γ亞基的相互作用。

10、這些結果顯示這些人il-2變體用于治療免疫疾病和用于增加針對疫苗的免疫應答的潛力。特別地，免疫病癥包括炎性疾病、過敏性疾病、感染性疾病和自身免疫性疾病、移植物抗宿主病(gvhd)、移植排斥反應和癌癥。疫苗可針對癌癥或感染性疾病。

11、本發(fā)明人還顯示il-2的表面重構變體也可用于篩選具有促teff或促treg活性的抗il-2抗體。

12、因此，本發(fā)明涉及能夠優(yōu)選刺激t-調(diào)節(jié)性細胞或拮抗il-2的白介素-2(il-2)變體，其在接觸α受體的區(qū)域之外的il-2的表面位置包含至少一個氨基酸取代。

13、在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的白介素-2變體在選自下組的位置包含至少一個氨基酸取代：9、12、16、19、23、26、31、87、91和95，其中：

14、-第9和12位的氨基酸被d或e，優(yōu)選e取代；

15、-第16、19、26、91和95位的氨基酸被k或r取代；優(yōu)選地，第16和19位的氨基酸被r取代，并且第26、91和95位的氨基酸被k取代；

16、-第23位的氨基酸被e、q、t、n、g、a、v、l或i，優(yōu)選l取代；

17、-第31位的氨基酸被p或n，優(yōu)選p取代；

18、-第87位的氨基酸被m、v、e、d、t、c、n或q，優(yōu)選n取代；并且

19、其中當所述取代在第91位時，則所述變體在第9、12、16、19、23、26、31、49、52、81、84、87、95、119、123、127、131或132位包含至少另一個取代，并且所指示的位置是通過與seqid?no:1比對來確定的。

20、在一些優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的變體在選自下組的位置包含一個或多個氨基酸取代：9、12、16、19、23、26、87、91和95，并且優(yōu)選在選自下組的位置包含至少一個另外的取代：31、49、52、81、84、119、123、127、131和132，其中：

21、-第31位的氨基酸被p或n，優(yōu)選p取代，并且，

22、-第49、52、84和132位的氨基酸被選自m、v、e、d、s、t、c、n和q的另一個氨基酸取代；優(yōu)選地，第49位的氨基酸被q取代；第52和132位的氨基酸被s取代；并且第84位的氨基酸被n取代；

23、-第81位的氨基酸被d或e，優(yōu)選e取代；

24、-第119、127和131位的氨基酸被k或r取代；優(yōu)選地，第127位的氨基酸被k取代并且第131位的氨基酸被r取代；并且

25、-第123位的氨基酸被e、q、n、m、g、a、v、l或i，更優(yōu)選a取代。

26、在一些其它的優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的變體在第31位包含一個取代并且在第9、12、16、19、23、26、49、52、81、84、87、91、95、119、123、127、131和132位不包含任何取代。

27、在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的變體是人il-2變體，其優(yōu)選選自下組：

28、-包含取代k9e、l12e、h16r、l19r、m23l、n26k、s87n、v91k、e95k、n119k、t123a、和s127k的變體；

29、-包含取代k9e、l12e、h16r、l19r、m23l、n26k、s87n、v91k、e95k、y31p、k49q、e52s、r81e、d84n、n119k、t123a、t131r和l132s的變體；

30、-包含取代y31p的變體，其中所述變體在第9、12、16、19、23、26、49、52、81、84、87、91、95、119、123、127、131和132位不包含任何取代；

31、-包含取代k9e、l12e、h16r、l19r、m23l、n26k、s87n、v91k、e95k、y31p、k49q、e52s、r81e、d84n、t131r和l132s的變體；

32、-包含取代k9e、l12e、h16r、l19r、m23l、n26k、s87n、v91k、e95k、y31p、n119k、t123a和s127k的變體；以及

33、-包含取代k9e、l12e、h16r、l19r、m23l、n26k、s87n、v91k、e95k、k49q、e52s、r81e、d84n、n119k、t123a、t131r和l132s的變體。

34、在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的變體與seq?id?no:1和3-8中的任一個具有至少70％的氨基酸同一性，并且優(yōu)選地其在以下位置不包含任何取代：11、13、15、18、20、22、29、30、35、37、48、68、69、71、74、75、76、80、85、86、88、92、110、125、126、129、130和133。

35、在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的變體優(yōu)選刺激t調(diào)節(jié)性細胞。

36、在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的變體是il-2拮抗劑，優(yōu)選其中所述il-2拮抗劑抑制t調(diào)節(jié)性細胞并因此刺激免疫應答，特別是cd8+t細胞應答。

37、在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的變體以諸如分子復合物、顆粒、綴合物或融合蛋白的形式與目標試劑結合。在一些優(yōu)選實施方案中，il-2變體與抗il-2抗體，優(yōu)選與具有促t調(diào)節(jié)性細胞或促t效應細胞活性的抗il-2抗體復合。在一些優(yōu)選實施方案中，il-2變體與針對treg特異性表面分子的抗體或其至少包含抗原結合位點的功能片段融合。針對treg特異性表面分子的抗體選自下組：抗ctla-4、抗cd25、抗ccr8、抗icos、抗ikzf2、抗cd70、抗garp、抗il1r1、抗cd39、抗ccr4和抗cd177抗體。

38、本發(fā)明涉及以可表達形式編碼所述變體的多核苷酸、包含該多核苷酸的載體，優(yōu)選表達載體、以及包含該多核苷酸或載體的宿主細胞。

39、本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含作為活性物質(zhì)的如本發(fā)明所公開的最終與目標試劑結合的il-2變體，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、載體和/或細胞，以及至少一種藥學上可接受的賦形劑和/或載體。

40、本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的il-2變體、多核苷酸、載體和/或細胞用于治療免疫病癥的用途。

41、在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選刺激treg的il-2變體(treg-激動劑變體)、多核苷酸、載體和/或細胞用于離體或體內(nèi)擴增treg以治療其中免疫調(diào)節(jié)或免疫抑制是有益的疾病，諸如但不限于過敏性和自身免疫性疾病，和包含免疫系統(tǒng)過度活化的疾病，其特別包括慢性或急性炎性疾病、移植物抗宿主病(gvhd)和移植排斥反應。

42、在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的il-2拮抗劑變體、多核苷酸、載體和/或細胞用于阻斷il-2介導的免疫系統(tǒng)過度活化，以治療包含與過度產(chǎn)生il-2相關的免疫系統(tǒng)的過度活化的疾病，特別是慢性或急性炎性疾病、移植物抗宿主病(gvhd)和移植排斥反應。

43、在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的il-2拮抗劑變體、多核苷酸、載體和/或細胞用于抑制treg，并因此刺激免疫應答，包括b、nk、cd4+或cd8+t細胞、dc、巨噬細胞等，特別是cd8+t細胞免疫應答，用于治療癌癥或感染性疾病或增加針對疫苗，特別是針對癌癥或感染性疾病的疫苗的免疫應答。

44、在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的il-2-拮抗劑變體、多核苷酸、載體和/或細胞與嵌合抗原受體t細胞療法、免疫調(diào)節(jié)性單克隆抗體療法或使用包括針對癌癥和感染病的治療劑和疫苗的抗癌劑或抗感染劑的療法聯(lián)合使用。在一些優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的il-2拮抗劑變體、多核苷酸、載體和/或細胞與至少一種選自下組的另外的癌癥療法聯(lián)合使用：靶向療法、免疫療法(諸如免疫檢查點療法和免疫檢查點抑制劑)、共刺激抗體、化療和/或放療。

45、本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的il-2變體用于篩選具有促t效應細胞或促t調(diào)節(jié)性細胞活性的抗il-2抗體的用途。